Обращённо-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография L-аминокислот и их производных

Глазев А.А., Нефёдов Л.И.

НИЛ биохимии биологически активных веществ ГрГУ им. Я. Купалы, г.Гродно, Республика Беларусь

Аминокислоты и их производные являются универсальными биомодификаторами и биорегуляторами важнейших метаболических реакций в организме человека и животных, а изменения их эндогенных концентраций служат достоверными показателями метаболического дисбаланса как важнейшего биохимического критерия происхождения и развития патологических процессов.

В настоящее время для аналитического определения свободных α-аминокислот и их производных в биологическом материале наиболее широко используются методы ионообменной или обращённо-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Нами разработан высокочувствительный и высокоселективный метод обращённо-фазной жидкостной хроматографии, позволяющий определять широкий спектр α-аминокислот и их дериватов в биологических жидкостях и тканях на хроматографе “HP-Agilent 1100 (USA)”.

Так как из-за весьма различающихся хроматографических свойств как самих аминокислот, так и их производных, одновременное их определение при постоянных во времени условиях хроматографического разделения затруднительно.

Поэтому разработанный метод позволяет определить достаточно широкую группу данных соединений в условиях изократического элюирования.

Для получения максимального отношения сигнал/шум и устранения дрейфа базовой линии выбор был сделан в пользу определения аминокислот в виде производных с ортофталевым альдегидом и 2-меркаптопропионовой кислотой и их детектирования по флуоресценции.

Преимуществом метода является его пригодность и для электрохимического детектирования из-за наличия электрофорных свойств у ортофталевых производных аминокислот, что дает возможность дополнительного повышения чувствительности на два порядка, в случае изократического элюирования.

Разделение свободных аминокислот и их дериватов методом обращённо-фазной жидкостной хроматографии проводили на аналитической колонке 3х150 мм, заполненной сорбентом Диасорб 130 С₁₆Т (6μм) с изократическим элюированием (0,1 М Na⁺-ацетатный буфер рН 5,7 : 50% метанол в соотношении 6,5:3,5), при скорости потока подвижной фазы 0,6 мл/мин, после предколоночной дериватизации с о-фталевым альдегидом и β-меркаптопропионовой кислотой и последующим флуориметрическим детектированием (231/445).

Выбор сорбента для этого разделения (Диасорб 130 С₁₆Т) обусловлен тем, что эффективность колонок с данным типом сорбента сохраняется высокой даже при высоких скоростях потока и это позволило значительно уменьшить длительность анализа при сохранении достаточно высокой разрешающей способности.

В качестве оптимальной была выбрана температура 30˚С, при которой колонка с данным типом сорбента показывала хорошее и воспроизводимое разделение.

В качестве реагента для предколоночной дериватизации использовали раствор ортофталевого альдегида в 0,4 М Na-боратном буфере рН 9,4, содержащий β-меркаптопропионовую кислоту. Дериватизацию проводили путем смешивания исследуемой смеси стандартов L-аминокислот и реагента в соотношении 1:3 и немедленно вводили в хроматограф.

Время с момента начала дериватизации до ввода пробы поддерживалось постоянным из-за химической нестойкости изоиндольных дериватов α-аминокислот с ортофталевым альдегидом и β-меркаптопропионатом. В качестве внутреннего стандарта использовали гомотаурин.

Воспроизводимость данного аналитического метода составляет 1,5%, максимальная чувствительность 5·10^-12 моль.

Разработанный метод внедрён и применяется в аналитической биохимии для определения α-аминокислот, их предшественников и метаболитов в образцах биологического материала, включая пищевые продукты, комбикорма, а также в лекарственных препаратах на основе композиций аминокислот и их производных.