Регулирующие нормофлору биотопа свойства лектинов пробиотического консорциума бактерий человека: скрининг, модуляция и селекция популяций лактобацилл из одного и того же  биотопа

Биологические науки/6.Микробиология

д.б.н. Лахтин В.М., к.б.н. Байракова А.Л., к.б.н. Лахтин М.В., Беликова Е.В., д.б.н. Афанасьев С.С., д.б.н. Алешкин В.А.

Отдел медицинской биотехнологии, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

Регулирующие нормофлору биотопа свойства лектинов пробиотического консорциума бактерий человека: скрининг, модуляция и селекция популяций лактобацилл из одного и того же биотопа

Резюме

С помощью лектинов пробиотиков проведены скрининг лактобацилл нормофлоры человека и их отбор в 7 функциональных групп. Продемонстрирована модуляция роста лактобацилл в присутствии лектинов. Результаты указывают на ауторегуляторные сигнальные свойства лектинов пробиотическиx микроорганизмов. Предложен простой методологический подход, позволяющий оценивать пробиотический потенциал биотопа как синбиотический в аутосистеме «Лектины лактобацилл - Лактобациллы».

Ключевые слова: лектиновая система, пробиотик, лактобациллы, микробиоценоз, биотоп.

Resume

Lakhtin V.M., Bajrakova A.L., Lakhtin M.V., Belikova Y.V., Afanasyev S.S., Alyoshkin V.A. Regulating properties of the human probiotic bacterial consortium lectins: Screening, modulation and selection of normoflora of Lactobacillus populations from the same biotope. Department of Medical Biotechnology, G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. Using probiotic bacterial lectins, screening Lactobacillus populations of human normoflora and their selection into 7 functional groups were developed. The modulation of lactobacilli growth in the presence of lectins was demonstrated. Results indicate autoregulating signal properties of probiotic microbial lectins. The simple methodological approach is proposed to evaluate biotope probiotic potential as synbiotic one in Lactobacillus autosystem “Lactobacillus lectins – Lactobacillus populations”.

Key words: lectin system, probiotic, lactobacilli, microbiocenosis, biotope.

Введение: Защитные лектины (распознающие гликоконъюгаты белки, пептиды и их комплексы) представлены в суперорганизме человека как собственные и пробиотические/симбиотические [1 - 3]. Нами из пробиотических штаммов лактобацилл и бифидобактерий человека были выделены и охарактеризованы имитирующие пробиотики синергидные препараты лектинов с набором регуляторных свойств метаболомбиотиков, включающих антимикробное и антипатогенное действие [2, 4, 5]. Однако влияние лектинов пробиотиков в отношении потенциального пробиотического компартмента биотопа не исследовалось. Цель – изучение взаимодействия лектинов лактобацилл (ЛЛ) пробиотических штаммов с популяциями лактобацилл нормофлоры урогенитального биотопа человека.

Материалы и методы: Препараты ЛЛ пробиотических штаммов (ингредиентов пробиотиков, предназначенных для человека) получали как описано ранее [4]. Исходная концентрация лектинов в физрастворе была 100 мкг/мл. В работе исследовали свежевыделенные штаммы лактобацилл, входящие в состав нормофлоры урогенитального тракта. Лактобациллы выращивали 2-3 суток при 37^оС в анаэробных генбоксах (GENbox, BioVerieux, Франция) на среде Lactobacillus MRC Agar (HiMedia Lab., Индия) и с использованием среды Шадлера [Shaedler] на агаровой основе. Идентификацию бактерий проводили с использованием дифференциально-диагностических сред. Бактерии культивировали в присутствии капельно или на дисках нанесенных лектинов на плотном агаре или после внесения лектинов в суспензии бактерий с известной оптической плотностью (D₅₄₀). Рассчитывали количество колониеобразующих единиц (КОЕ) с учетом разведений.

Использовали метод серийных разведений для оценки антимикробной активности ЛЛ (таблица 1). Определение концентрации культуры по оптической плотности проводили на денсилометре (Densi-la-Meter, Erba Lachema, Чехия).

Диск-лектины получали и использовали, как описано ранее [5]. Измеряли на агаре диаметры зон вокруг дисков с отсутствием роста бактерий (таблица 2).

Результаты усреднены по трем измерениям.

Результаты: В таблице 1 приведены данные о взаимодействии ЛЛ с штаммами лактобацилл в составе клеточных суспензий. Препарат ЛЛ в разбавлениях в 10-1000 раз проявлял бактериостатическое действие в отношении щтаммов 296, 2, 14 и 30. Препарат оказывал умеренное бактериостатическое действие на штаммы 21 и 51 при разбавлениях 1:100 и выше. Исследование ЛЛ в более широком диапазоне концентраций в отношении штамма 856 показало выраженное бактериостатическое действие препарата в разбавлениях в 10-1000 раз. Мутность суспензии (D₅₄₀) лактобацилл до внесения лектинов мало влияла на характер взаимодействия препарата с клетками, однако более низкая плотность суспензии была предпочтительной при исследовании расширенного спектра свойств лектинов.

Результаты с использованием капельно или на дисках нанесенных на агар лектинов были качественно сходными. Результаты дополнительных исследований различных концентраций препарата в условиях роста культуры на плотной дифференциальной среде в присутствии дисков с ЛЛ подтвердили антимикробное действие препарата в отношении Lactobacillus spp. в разбавлениях 1:10 и 1:100. Результаты приведены в таблице 2. Полученные данные были сходными с результатами, полученными другим методом (таблица 1). Препарат ЛЛ оказывал выраженное или умеренное бактериостатическое действие в отношении ряда штаммов. Суспензии лактобацилл с плотностью 2 позволяли более отчетливо выявлять эффект супрессии роста по сравнению с суспензиями с плотностью 1.

По результатам таблиц 1 и 2 все штаммы были разделены на 7 групп с указанием вероятных функций популяций лактобацилл в биотопе (таблица 3).

Обсуждение результатов: В работе установлены внутренне присущие биотопным микробиоценозам тесные взаимоотношения между лектинами, продуцируемыми пробиотическими бактериями (их консорциумами, часто используемыми при конструировании пробиотиков, как в случае пробиотика «Ацилакт») и варьирующими популяциями полезной микрофлоры (на примере лактобацилл). В 2004 году мы предположили и затем показали, что лектины пробиотических лактобацилл и бифидобактерий реализуют спектр полезных для человека активностей (в том числе каскадных) и тем самым участвуют в сигнальных коммуникациях в направлениях «Микроб - Микроб» и «Микроб - Хозяин» [2, 4, 5, 6]. Участие пептидов и белков пробиотических бактерий в коммуникациях типа чувства кворума [quorum sensing] и кросс-токинга [cross-talking] в обоих направлениях в настоящее время не вызывает сомнений [7 - 10]. Разнообразие коммуникационных связей пробиотических микроорганизмов обусловлено именно участием белковых и пептидны сигналов [9]. Анализ секретома лактобацилл выявил набор типов лектиновых и сходных с лектинами ключевых метаболомных белков [11]. Результаты настоящей работы указывают на то, что узнающие белки (лектины пробиотической нормофлоры - ЛЛ) вовлекаются в процессы чувства кворума лактобацилл в условиях совместной инкубации. Результаты демонстрируют наличие ауторегуляторных дифференцированно модулирующих рост популяций лактобацилл возможностей лектинов пробиотиков. Полученные данные подтверждаются и другими исследователями, показавшими, что динамика процессов «сгущение - разбавление» популяций лактобацилл в условиях выживания при стрессе (и ожидаемом появлении сигналов чувства кворума и кросс-токинга) регулирует иерархические надстроечные составляющие выживания (метаболические сети и обратимый морфогенез) лактобацилл [12].

Заключение: В целом, полученные результаты расширяют представления о ключевых функциях лектинов пробиотических микроорганизмов в организме человека (его биотопах). Пробиотические лектины не только осуществляют надзор против экспрессии негативных свойств условно-патогенной микрофлоры и поддерживают защитные системы хозяина, но и, как оказалось, участвуют в сигнальном мониторинге для поддержки здорового статуса самого пробиотического компартмента биотопа. Полученные данные указывают на новые перспективные области применения лектинов пробиотиков в индустриальной, медицинской и пищевой биотехнологии и микробиологии.

Литература:

1. Лахтин М.В., Караулов А.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. Лектин-гликоконъюгатные системы в организме человека // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2012. - № 1. - С. 27 - 36.

2. Лахтин М.В., Алешкин В.А., Лахтин В.М., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Роль лектинов пробиотических микроорганизмов в жизнеобеспечении макроорганизма // Вестник РАМН. - 2010. - № 2. - С. 3 - 8.

3. Lakhtin M., Lakhtin V., Alyoshkin V., Afanasyev S. Lectins of beneficial microbes: system organization, functioning and functional superfamily // Beneficial Microbes. - 2011. – V. 2; No 2. – P. 155 – 165.

4. Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Pospelova V.V., Shenderov B.A. Lactobacillus and bifidobacterial lectins as possible signal molecules regulating intra- and interpopulation bacteria-bacteria and host-bacteria relationships. Part I. Methods of bacterial lectin isolation, physicochemical characterization and some biological activity investigation // Microb. Ecol. Health. Dis. - 2006. - V. 18; No 1. - P. 55 - 60.

5. Lakhtin M., Alyoshkin, V., Lakhtin V., Afanasyev, S., Pozhalostina, L., and Pospelova, V. Probiotic lactobacillus and bifidobacterial lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: new class of pathogen biofilm destructors // Probiotics & Antimicrobial Proteins. – 2010. – V. 2; No 3. – P. 186 – 196. DOI: 10.1007/s12602-010-9046-3.

6. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Поспелова В.В. Лектины, адгезины и лектиноподобные белки лактобацилл и бифидобактерий // Сборник материалов международной конференции “Пробиотики, пребиотикии, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы”(1-4 июня 2004, Москва). - Москва. - 2004. - С. 7 - 8.

7. Петров Л.Н., Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Воробьев А.А. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. – 2006. - № 1. – С. 38 – 45.

8. Среди пептидных компонентов чувства кворума пептидные аутоиндукторы типа AI-2 Moslehi-Jenabian S, Gori K, Jespersen L. AI-2 signalling is induced by acidic shock in probiotic strains of Lactobacillus spp. // Int. J. Food Microbiol. - 2009. – V. 135. – P. 295 - 302.

9. Шендеров Б.А. Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2009. - № 1. – С. 47 – 48.

10. Remus DM, Kleerebezem M, Bron PA. An intimate tête-à-tête - how probiotic lactobacilli communicate with the host // Eur. J. Pharmacol. – 2011. – V. 668; Suppl. 1. - P. S33 - S42.

11. Zhou M., Theunissen D., Wels M., Siezen R.J. LAB-Secretome: a genome-scale comparative analysis of the predicted extracellular and surface-associated proteins of lactic acid bacteria // BMC Genomics. – 2010. - 11:651; www.biomedcentral.com/1471-2164/11/651

12. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Иланенко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочно-кислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. – 2011. – Т. 78. – С. 317 – 335.

Таблица 1. Взаимодействие препарата ЛЛ и штаммов Lactobacillus spp. по

данным метода серийных разведений (даны значения КОЕ/мл).

Штаммы (Группы)**	Разведения препарата
Штаммы (Группы)**	1:10 А	1:100 Б		1:1000 В	1:10 Г	1:100 Д		1:1000 Е
2 (II)	5*10⁷	4*10⁶		10⁶	10⁹	3*10⁸		10⁸
9 (I)	5*10⁸	5*10⁸	5*10⁸		5*10⁹	5*10⁹	5*10⁹
14 (II)	5*10⁶	4*10⁶		10⁶	5*10⁶	3*10⁶		10⁶
15 (I)	10⁸	10⁸		10⁸	5*10⁹	5*10⁹		5*10⁹
21 (II)	5*10⁷	3*10⁷		10⁷	5*10⁸	4*10⁸		10⁸
30 (III)	5*10⁵	5*10⁵		10⁶	10⁵	10⁵		10⁵
51 (II)	5*10⁸	10⁸		10⁸	10⁹	5*10⁸		3*10⁸
53 (II)	5*10⁷	4*10⁷		10⁷	5*10⁸	3*10⁸		10⁸
54 (I)	5*10⁷	5*10⁷		5*10⁷	5*10⁸	5*10⁸		5*10⁸
215 (I)	5*10⁷	5*10⁷		5*10⁷	5*10⁷	5*10⁷		5*10⁷
239 (III)	10⁷	10⁷		5*10⁷	10⁸	10⁸		10⁸
288 (I)	5*10⁸	5*10⁸		5*10⁸	5*10⁹	5*10⁹		5*10⁹
296 (I)	5*10⁷	5*10⁷		5*10⁷	5*10⁹	5*10⁹		3*10⁸
664 (I)	5*10⁷	5*10⁷		5*10⁷	5*10⁹	5*10⁹		5*10⁹
683 (III)	10⁷	5*10⁷		6*10⁷	5*10⁸	5*10⁸		5*10⁸
856 (II)	10⁷	10⁷		10⁷	5 10⁷	5*10⁶		10⁶

Суспензии лактобацилл с мутностью 0.5 (А, Б, В) или 5.0 (Г, Д, Е).

**Группы: штаммы с противоположным ответом на ЛЛ (II, III) или

резистентные к ЛЛ (I).

Таблица 2. Взаимодействие препарата ЛЛ и штаммов Lactobacillus spp. по

данным диск-лектинового метода (зоны отсутствия роста, мм).

Штаммы (Группы**)	Разведения препарата
	1:10 А*	1:10 Б	1:100 В	1:100 Г
2 (II)	14,0	17,0	14,0	19,0
9 (III)	14,0	21,0	14,0	14,0
14 (I)	18,0	14,0	14,0	14,0
15 (II)	14,0	14,0	22,0	24,0
21 (II)	14,0	14,0	16,0	18,0
30 (II)	21,0	35,0	14,0	14,0
51 (I)	14,0	14,0	14,0	14,0
53 (II)	14,0	14,0	14,0	21,0
54 (II)	14,0	14,0	14,0	19,0
215 (I)	14,0	14,0	14,0	14,0
239 (III)	16,0	17,0	16,0	16,0
288 (I)	14,0	14,0	14,0	14,0
296 (II)	18,0	17,0	19,0,0	21,0
664 (I)	14,0	14,0	14,0	14,0
683 (I)	17,0	17,0	17,0	17,0
856 (III)	14,0	33,0	14,0	25,0

*Суспензии лактобацилл с мутностью 2 (А, В) или 1 (Б, Г).

**Группы: штаммы с противоположным ответом на ЛЛ (II, III) или

резистентные к ЛЛ (I).

Таблица 3. Группотипирование популяций лактобацилл нормофлоры

урогенитального биотопа лектинами пробиотических лактобацилл

человека (по результатам таблиц 1 и 2).

Группы	Штаммы	Отношение к лектинам	Предполагаемые функции популяций в биотопе
I	215, 664, 288	Резистентные	Пробиотик-подобные популяции, толерантные к сигналам пробиотиков
II, III	2, 9, 14, 15, 21, 30, 51, 53, 54, 239, 296, 683, 856	Чувствительные	Модулируемый и управляемый пробиотическим компартментом пул популяций
II/I	14, 15, 51, 54, 296,	Резистентные в одних и слабо супрессируемые в других условиях	Близкие к пробиотик-подобным популяциям, с обратимыми изменениями
III/I	9, 683	Резистентные в одних и слабо индуцируемые в других условиях	Близкие к пробиотик-подобным популяциям, с обратимыми изменениями
II/III	30, 856	Выраженно модулируемые	Сенсоры и передатчики сигналов, образующие инфосеть
II	2, 21, 53	Супрессируемые выраженно и умеренно	Мишени элиминации пробиотиками, как ослабленные неконкурентные и потенциально измененные в сторону патологии популяции
III	239	Индуцируемый	Активный участник чувства кворума, вовлекаемый в регуляцию плотности популяции