Д.б.н. Титов В.Ю.

Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства, Россия

Иванова А.В.

Российский государственный медицинский университет, Россия

Д.б.н. проф. Ванин А.Ф.

Институт химической физики РАН им. Н.Н.Семенова, Россия

Ферментный сенсор открывает новые возможности в изучении метаболизма оксида азота в норме и при патологии

Оксид азота (NO) синтезируется в тканях человека и животных из аминокислоты L-аргинина. Он является универсальным медиатором, опосредующим тонус гладкой мускулатуры сосудов и ж.к.т. (через активацию гуанилатциклазы), деятельность центральной и вегетативной нервной системы [1], дифференциацию тканей и апоптоз (посредством регуляции активности каспазы [2]), иммунный ответ [1], регуляцию экспрессии ряда генов [3]. Овладение регуляцией эффектов NO даст колоссальный потенциал для коррекции физиологического статуса организма.

Однако в настоящее время эффекты оксида азота, практически, не используются. Основной причиной, ограничивающей какие – либо работы в этой области, является недостаток сведений о метаболизме NO в организме животных и человека. Известно, что оксид азота в биообъектах быстро окисляется до нитрита и нитрата. Время его полужизни в биообъектах – от долей секунды до нескольких секунд. В то же время продолжительность физиологических эффектов NO многократно больше. Это связывают с наличием соединений – доноров NO, которые также образуются при его метаболизме и выполняют роль депо оксида азота [4]. В качестве таких соединений рассматриваются S-нитрозотиолы (RSNO), динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) [5,6]. Есть мнение, что некоторые высокомолекулярные нитраты (RNO₂) также способны выполнять эту функцию [7]. Из результатов работ Ванина А.Ф. и сотр. [5,6] вырисовывается такая обобщенная схема физиологических эффектов NO:

RSH Fe²⁺

NO → RSNO → ДНКЖ → NO – мишень → NO3^-

Но остаются неясными следующие аспекты: под действием каких факторов происходит высвобождение оксида азота из соединений – депо? И что является регулятором их физиологического эффекта? Знание этих аспектов и является ключом к решению проблемы практического использования NO и ее метаболитов.

Но для этого необходимы методики, способные обеспечить контроль за содержанием и метаболизмом всех производных оксида азота в биообъектах, и, прежде всего, соединений – доноров NO. К сожалению, применяющиеся до сих пор методы оценки их содержания не обладают высокой избирательностью. Все они требуют предварительной очистки образца и создания нефизиологической среды, что приводит к неконтролируемой деструкции исследуемых соединений [8,9]. Так S-нитрозотиолы и ДНКЖ нередко определяются классическим методом Грисса как нитрит. Динитрозильные комплексы железа определяют по характерному ЭПР – сигналу. Но, как было установлено, далеко не все такие комплексы можно зарегистрировать этим способом [9].

Разработанный нами ферментный сенсор позволяет с высокой точностью (до 50 нМ) и с высокой специфичностью определить основные группы метаболитов NO в биообъекте без его предварительной очистки. Он основан на уникальном свойстве нитрита (NO₂^-), N-нитрозосоединений (RNNO), S-нитрозотиолов (RSNO), динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) ингибировать фермент каталазу в присутствии галоид-ионов, и на утрате ими этого свойства под действием определенных химических агентов, различных для каждой группы соединений [10]. Так ДНКЖ разрушаются хелаторами железа (ЭДТА), а высвобождающаяся из них NO перехватывается оксигемоглобином, в связи с чем ингибирующий эффект утрачивается. RSNO трансформируются в ДНКЖ под воздействием закисного железа и приобретают его свойства. Нитрит и RNNO не продуцируют в нейтральной среде нитрозильных комплексов железа и не теряют способности ингибировать каталазу в среде, содержащей хелатор железа и ловушку NO ни до, ни после добавления закисного железа и тиолов. Других эффективных ингибиторов каталазы биообъекты в норме не содержат [9]. Высокомолекулярные нитраты (RNO₂) приобретают ингибирующие свойства ДНКЖ в присутствии закисного железа и тиолов. Нитрат (NO₃^-) – не приобретает [10]. Под воздействием треххлористого ванадия все нитросоединения восстанавливаются до нитрозосостояния и приобретают способность ингибировать каталазу [10].

Согласно полученным данным, все основные физиологические жидкости: кровь, амниотическая жидкость, молоко, сперма в норме, практически, не содержат нитрит и RNNO – их концентрация менее 100 нМ. Нитрит, экзогенно добавленный в эти объекты, определялся как нитрит в расчетной концентрации. Такие объекты как амнион и сперма содержали в следовых количествах не только нитрит, но и нитрат, а метаболиты NO в этих объектах представлены, преимущественно, S-нитрозотиолами, ДНКЖ и высокомолекулярными нитратами (RNO₂) [9,10]. Таким образом, в норме в живых тканях существуют механизмы, предотвращающие образование нитрита и RNNO из оксида азота. Теоретически это может быть достигнуто при двух условиях:

1. Если образование S-нитрозотиолов не будет сопровождаться продукцией нитрита. Считается, что они, преимущественно, образуются следующим образом [11]:

4NO + O₂ → 2N₂O₃ + 2RSH → 2RSNO + 2NO₂^-+2H⁺

Но в этом случае на одну молекулу S-нитрозотиола должна продуцироваться одна молекула нитрита, что противоречит нашим экспериментальным данным. Остается другой путь:

NO⁺ + RSH → RSNO + H⁺

Однако, в этом случае весь синтезированный NO должен быть каким-то образом окислен до иона нитрозония. Как это может произойти, пока не ясно.

2. Если при передаче с донора на мишень NO не будет выделяться в свободном виде в окружающую среду, либо ее пребывание там будет минимальным. Нами показано, что S-нитрозотиолы и ДНКЖ в физиологических условиях являются устойчивыми соединениями. Передача NO с ДНКЖ на мишень происходит в том случае, если на комплекс в присутствии ловушки NO воздействует деструктивный агент: например, хелатор железа. При этом не происходит предварительного высвобождения NO в реакционную среду, о чем судили по отсутствию образования нитрита в среде. Высказано предположение, что подобный механизм может лежать в основе регуляции физиологических эффектов NO [9, 12].

Но нитрит и RNNO зарегистрированы нами в образцах плазмы крови больных, страдающих различными воспалительными заболеваниями, и вновь снижалось до следовых количеств при выздоровлении [9, 13]. Причем, появление нитрита и RNNO в конц. выше 150 нМ оказалось значительно более чувствительным критерием воспаления, чем показатели СОЭ, числа лейкоцитов [13]. Содержание нитрата в крови больных при этом существенно не изменялось [13].

При стимуляции лейкоцитов плазмы зимозаном также наблюдалось появление NO₂^- + RNNO при пропорциональном снижении содержания нитрозосоединений – доноров NO. Содержание нитрата при этом не изменялось. При наличии в реакционной среде оксигемоглобина – ловушки NO, происходит только снижение содержания доноров без образования нитрита и RNNO. Присутствие системы 100 мкМ аскорбата + 1мМ глютатиона – ловушки активных форм кислорода, в 2,5 раза снижает образование NO₂^- + RNNO и, соответственно, убыль соединений – доноров NO. Добавление аскорбата и глютатиона в плазму через 2 ч. после активации зимозаном, когда активированные лейкоциты погибают [9,13], не привносило каких-либо изменений в состав нитро- и нитрозосоединений плазмы.

Таким образом, есть основание предполагать, что появление нитрита и RNNO при воспалении связано, главным образом, не с интенсификацией индуцибельной NO-синтазы, как предполагается в литературе, а с воздействием активных форм кислорода на соединения – доноры NO.

Вышеизложенные факты позволяют сделать следующие выводы:

1. Живые ткани в норме имеют механизм, предотвращающий окисление оксида азота до токсического нитрита. Высвобождение NO из соединений-депо осуществляется без выхода молекулы оксида азота в окружающую среду, либо ее пребывание там минимально, что позволяет избежать окисления кислородом.

2. Широко распространенная оценка интенсивности синтеза NO по величине суммарной концентрации нитрита и нитрата – конечных продуктов метаболизма NO, не является корректной, поскольку их содержание – результат не только синтеза NO, но и метаболизма соединений-доноров, которые в ряде биообъектов (амнион, сперма) составляют основу всего пула нитро- и нитрозосоединений.

3. Появление нитрита и N-нитрозосоединений в плазме крови при воспалительных заболеваниях является, главным образом, результатом деструкции соединений – доноров NO, предположительно, под воздействием активных форм кислорода, продуцируемых активированными лейкоцитами, а не интенсификации синтеза NO.

Литература:

1. Moncada, S.; Palmer, R.; Higgs, E. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharm. Rev., 1991, 43, 109-142.

2. Kim, Y-M.; Chung, H-T.; Simmons, R.; Billiar, T. Cellular nonheme iron content is a determinant of nitric oxide-mediated apoptosis, necrosis, and caspase inhibition. J. Biol. Chem., 2000, 275,10954-10961.

3. Zhou, J.; Brune, B. NO and transcriptional regulation: from signaling to death. Toxicology, 2005, 208, 223-233.

4. Rassaf, T.; Preik, M.; Kleinbongard, P.; Lauer, T.; Hei, C.; Strauer, B-E.; Feelisch, M.; Kelm, M. Evidence for in vivo transport of bioactive nitric oxide in human plasma. J. Clin. Invest., 2002, 109, 1241-1248.

5. Vanin, A.; Muller, B.; Alencar, J.; Lobysheva, I.; Nepveu, F.; Stoclet, J-C. Evidence that intrinsic iron but not intrinsic copper determines S-nitrosocysteine decomposition in buffer solution. Nitric Oxide, 2002, 7, 194-209.

6. Severina, I.; Bussygina, O.; Pyatakova, N.; Malenkova, I.; Vanin, A. Activation of soluble guanylate cyclase by NO donors – S-nitrosothiols, and dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands. Nitric Oxide, 2003, 8,155-163.

7. Lima, E.; Bonini, M.; Augusto, O.; Barbeiro, H.; Souza, H.; Abdalla, D. Nitrated lipids decompose to nitric oxide and lipid radical sand cause vasorelaxation. Free Radic. Biol. Med., 2005, 39, 532-539.

8. Tsikas, D. Simultaneous derivatization and quantification of the nitric oxide metabolites nitrite and nitrate in biological fluids by gas chromatography/mass spectrometry. Anal. Chem., 2000, 72, 4064-4072.

9. Titov, V. The Enzymatic Technologies Open New Possibilities for Studying Nitric Oxide (NO) Metabolism in Living Systems. Current Enzyme Inhibition, 2011, 7, 56-70.

10. Titov, V.; Petrenko, Yu.; Vanin, A.; Stepuro, I. Detection of nitrite and nitrosocompounds in chemical systems and biological liquids by the calorimetric method. Biophysics, 2010, 55, 77-86.

11. Gaston, B. Nitric oxide and thiol groups. Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1411, 323-333.

12. Titov, V. Mechanisms of interaction of nitric oxide (NO) and its metabolites with enzymes responsible for the physiological effects of NO. Curr. Enzyme Inhib., 2008, 4, 73-81.

13. Титов В.Ю., Иванова А.В., Агапов М.А., Петров В.А. Содержание нитрита и N-нитрозосоединений плазмы как важный диагностический показатель. // Клиническая лабораторная диагностика, 2011, № 11, с. 13-19.