К. ф.-м. н. Валуева С. В., Боровикова Л. Н., Волков А. Я.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия

БИОГЕННЫЕ НАНОРАЗМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА И ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ: САМООРГАНИЗАЦИЯ, СТРУКТУРА, ТЕРМОДИНАМИКА

Полиэлектролитные комплексы (ПЭК) додецилсульфата натрия (ДСН) с катионным сополимером N-винилпирролидона и N,N,N,N-триэтилметакрилоилоксиэтиламмоний йодида (ВП-КС) в зависимости от мольного соотношения заряженных субъединиц g (g=ДСН/КС) в комплексе проявляют различную биоактивность: при g=0.5 ПЭК ингибирует рост животных, а при g=4.0 обладает максимальной ростстимулирующей активностью [1].

ПЭК

CH₃

^|

-(CH₂-CH-)_83мол%-(CH₂-C-)_17мол%-

ê ê

N C=O [CH₃(CH₂)₁₁OSO₃ ^– Na⁺]

/ \ ê

O=C CH₂ O-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)₃ J^-

\ /

H₂C – CH₂

ВП - КС ДСН

Эти комплексы различаются и в структурном отношении [2]: при g=0.5 ПЭК представляют собой димеры ДСН, связанные за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий с КС (I), а при g=4.0 формируются нестехиометрические ПЭК, представляющие собой мицеллы ДСН (кластер из ~1000 молекул ДСН), стабилизированные электростатическим взаимодействием с полиэлектролитной цепочкой (II).

Особый интерес представляет стабилизация полиэлектролитными комплексами наночастиц нуль-валентного аморфного селена (Se⁰), т.к. нами установлено [3], что Se⁰, стабилизированный бычьим сывороточным альбумином имеет низкую токсичность и сохраняет профиль биологической активности, который характерен для ионных форм селена. Учитывая тот факт, что указанные выше ПЭК обладают мембранотропными свойствами и резко увеличивают проницаемость липидных бислоев [4], они могут повысить уровень активности селена. Поэтому представлялось целесообразным осуществить синтез Se⁰ в водном растворе ПЭК с g=0.5 и g=4.0 и определить кинетические, структурные и термодинамические характеристики формирующихся при этом наносистем.

В работе использовали ПЭК с М_w=117´10³ (g=0.5) и М_w=385´10³ (g=4.0); ММ катионного сополимера П(ВП-КС) составила М_w=85´10³. Реакцию восстановления ионного селена проводили в условиях полного насыщения адсобционной емкости наночастиц селена [5]: при концентрации селена в водном растворе 0.01% и массовом соотношении селен:полимер ν = 0.1; рН реакционной массы составляла 3.2-4.0 (таблица).

Измерения оптической плотности проводились на спектрофотометре «Specord M40» (Карл Цейс Йена, Германия) в диапазоне длин волн 220 – 800 нм, с толщиной фотометрического слоя 1 см. Величины константы скорости k* процесса самоорганизации селенсодержащих наносистем приведены в таблице. Расчет k* был проведен по формуле [6] k* = log(D_k/(D_k – D_i))/t_i , где D_k – оптическая плотность, характеризующая конец процесса (в нашем случае 24 часа), D_i – оптическая плотность в данный момент времени t_i.

Таблица. Кинетические, структурные и термодинамические параметры гибридных наносистем ПЭК различного состава с наночастицами селена и их компонентов.

Система	pH	к^* ´10^3,с^-1	Mw^* ´ 10^-3	N ^*	p*	Rg^*= Rh^*, нм	Ф*, г/см^3	А2^*´10^4, см^2моль/г^2
ПЭК-Se^0 g=0.5	3.8	0.9	10 ´ 10^3	85	1.0	40	0.03	0.2
ПЭК-Se^0 g=4.0	3.2	1.0	200 ´ 10^3	520	1.0	60	0.17	-0.8
ДСН-Se^0	3.5	0.7	29 ´ 10^3	10^5	1.0	40	0.08	0.2
П(ВП-КС)-Se^0	4.0	0.6	23 ´ 10^3	270	1.2	50	0.03	0.2

Методом статического рассеяния света [7] определяли молекулярные массы M_w^* и среднеквадратичные радиусы инерции R_g^* наноструктур, a также по величинам второго вириального коэффициента А₂^* - их сродство к растворителю. По соотношению величин MМ для ПЭК и образуемых ими наноструктур вычисляли количество N^* адсорбированных ПЭК на поверхности наночастиц Se⁰. Для измерения приведенной интенсивности рассеяния растворов R_q использовали фотогониодиффузометр “Fica”. Длина волны падающего вертикально поляризованного света составляла 546.1 нм. Измерения проводили для углов рассеяния в интервале q = 30 - 150⁰. Очистку водных растворов наносистем и растворителя (вода) осуществляли центрифугированием при 15 ´ 10³ об/мин в течение 1-1.5 ч. Значения инкремента показателя преломления dn/dc получали из рефрактометрических измерений на приборе ИРФ-23. Для исследованных наносистем ПЭК-Se⁰ dn/dc=0.244 (g=0.5), dn/dc=0.198 (g=4.0), ДСН-Se⁰ dn/dc=0.183, П(ВП-КС) dn/dc=0.249. Обработку экспериментальных данных светорассеяния для растворов нанострукур осуществляли по методу Зимма путём двойной экстраполяции (к с=0, q = 0) графиков зависимости Kс / R_q от sin²(q/2) + kc (K – калибровочная константа, k – численная константа).

Методом динамического светорассеяния (ДСР) [8] определяли средние гидродинамические радиусы наноструктур R_h^*, которые рассчитывали из значений коэффицентов диффузии (D^*) по уравнению Эйнштейна – Стокса R_h^* = kT/6πη₀D^* (η₀ – вязкость растворителя). Оптическая часть установки для измерения динамического рассеяния света укомплектована гониометром ALV-SP (Германия) (источник света - гелий-неоновый (He-Ne) лазер Spectra-Physics с длиной волны l = 632.8 нм, мощностью ~20 mV). Корреляционную функцию интенсивности рассеянного света получали с помощью коррелятора Photo Cor-FC с числом каналов 288 (изготовитель – ЗАО “Антекс”, Россия). Анализ корреляционной функции осуществляли с помощью программы обработки данных динамического светорассеяния Dynals (фирма “Гелиос”, Россия).

По соотношению экспериментальных величин R_g^* и R_h^* находили значение структурно - конформационного параметра r^* = R_g^*/ R_h^* [9].

На основании данных по M_w^* и среднеквадратичным радиусам инерции по формуле (1):

F^* = 3 M_w^*/4pN_aR³_cф (1)

(здесь R_cф = 1.29 R_g^*) определяли величины средней плотности наноструктур F^* [10]. Значения F^* приведены в таблице.

Рентгенографические исследования в широких углах проводили на дифрактометре SEIFERT XRD 3003 TT (GE, Германия) снабжённого первичным монохроматором (при U=40 kV, I=40 mA). Использовали Cu K_α -излучение с длиной волны λ = 1.5406 Å. Дифрактограммы получали в области углов рассеяния 2θ = 5÷ 40⁰, с шагом 0.05⁰ и временем сканирования 5 секунд в каждой точке области углов рассеяния.

Методом двойного лучепреломления в потоке (ДЛП) [11] по характеру градиентной зависимости величины ДЛП Dn оценивали молекулярную дисперсность растворов образующихся наноструктур. При этом величину ДЛП Dn определяли в зависимости от градиента скорости вращения ротора (g) и концентрации (с) ПЭК (или их компонентов) при фиксированной концентрации селена. Использовали титановый динамооптиметр с внутренним ротором высотой 4 см и величиной зазора между ротором и статором 0.03 см. Все исследования ДЛП проводили при термостатировании растворов (21⁰C) во избежание изменений их вязкости и оптических искажений, вызываемых температурным градиентом. Для градуировки установки применяли фенилэтиловый спирт, который обладает значительным ДЛП (Dn/g= 17´10^-12), а также систему полистирол-бромоформ. Погрешность определения характеристической величины ДЛП [n] = lim_{g®0, c®0} (Dn/gсh₀) (где h₀ – вязкость растворителя) не превышала 10%. Измерения проводили при g< g_k, где g_k – градиент скорости при котором наступает турбулентность потока.

Экспериментальная величина [n] в общем случае dn/dc ¹ 0 складывается из трех эффектов: [n] = [n]_e + [n]_fs + [n]_{f ,} где [n]_e – собственная анизотропия, [n]_fs- эффект микроформы, [n]_f - эффект макроформы [11]. При этом величина полной сегментной анизотропии [n]_fs + [n]_e определяется равновесной жесткостью А полимерной цепи и структурой элементарного звена полимера, а величина [n]_f связана с асимметрией формы частицы p соотношением:

[n]_f = ((n²_s + 2)/3)²´ (M_w^*(dn/dc)²f(p))/(30 p RTn_s) =

constM_w^*(dn/dc)²f(p) , (2)

где n_s – показатель преломления растворителя, T – абсолютная температура, R- универсальная газовая постоянная, f(p)- табулированная функция отношения осей жесткого (непротекаемого для растворителя) эллипсоида, аппроксимирующего частицу [11]. Соотношение (2) справедливо как для изолированной макромолекулы, так и для наноструктуры, причем единственным требованием является отсутствие эффекта протекаемости частицы для растворителя.

В настоящее время идентифицированы следующие модификации селена: аморфный селен (а–Se⁰), имеющий красную окраску, а также три кристаллические формы селена - тригональный (t–Se⁰); a–, b–, g– моноклинный (красный селен) и ромбоэдрический селен, состоящих из колец Se₈. Три модификации красного кристаллического селена с моноклинной решеткой: α-Se оранжево-красного цвета (a = 0.9054 нм, b = 0.9083 нм, c = 1.1601 нм, угол b = 90.81°, температура плавления 170°C, плотность 4.46 г/см³), b-Se темно-красного цвета (a = 1.285 нм, b = 0.807 нм, c = 0.931 нм, угол b = 93.13°, температура плавления 180°C, плотность 4.50 г/см³) и g-Se красного цвета (a = 1.5018 нм, b = 1.4713 нм, c = 0.8789 нм, угол b = 93.61°, плотность 4.33 г/см³) [12].

Синтез селенсодеоржащих наносистем проводился на основе реакции: H₂SeO₃+ 2C₆H₈O₆ → Se+3H₂O+ 2C₆H₆O₆

В результате этой реакции при восстановлении селенистой кислоты в водной среде должен образовываться красный аморфный селен [13], который представляет собой неорганический полимер с ковалентно связанными цепями, образующими малоупорядоченную структуру (рис. 1) с плотностью 4.28 г/см³ [12].

Рис. 1. Расчитанная эмпирически модель аморфного Se [12].

Образование красного аморфного селена было подтверждено методом рентгено-структурного анализа: так на приведенной на рис. 2а дифрактограмме наносистема ПЭК-Se⁰ (γ=4.0) отсутствуют рефлексы, характерные для кристаллических аллотропных форм селена [14, 15], а рефлексы в области углов 2θ = 4.06÷4.36⁰; 12.9⁰; 20.38÷21.87⁰ обусловлены наличием в наносистеме ПЭК-Se⁰ (γ=4.0) додецилсульфата натрия (рис. 2б), который при этом сохраняет кристаллическую структуру [16].

I(отн.ед.)

2θ

а)

I (отн.ед.)

2θ

б)

Рис. 2. Дифрактограммы для наносистемы ПЭК-Se⁰ (γ=4.0) (а) и ДСН (б).

При восстановлении селенистой кислоты в присутствии ПЭК константы скорости процесса самоорганизации наносистем k^* для g=0.5 и 4.0 составили соответственно 0.9´10 ^–3 с^-1 и 1.0´10 ^–3 с^-1 (таблица), т.е. скорость реакции не зависит от g в исследованном диапазоне варьирования g. В тоже время для селенсодержащих наносистем на основе ВП-КС и ДСН величина константы скорости несколько меньше, чем для наносистем ПЭК-Se⁰ и составляют соответственно 0.6´10 ^–3 с^-1 и 0.7´10 ^–3 с^-1 (таблица).

Полученные зависимости оптической плотности D от длины волны λ для систем ПЭК-Se⁰ (g=0.5 и g=4.0), ДСН-Se⁰ и П(ВП-КС) показывают отсутствие поглощения при λ = 546.1 (рабочая длина волны в методе статического светорассеяния) и 632.8 нм (рабочая длина волны в методе динамического светорассеяния), что позволяет использовать для изучения структурных и термодинамических параметров методы молекулярной оптики.

По данным статического рассеяния света величина М_w^* при переходе от g=0.5 (М_w^* =10×10⁶) к g= 4.0 (М_w^* = 200´10⁶) возрастала в 20 раз, т.е. на поверхности наночастиц Se⁰ адсорбировалось соответственно 85 и 520 частиц ПЭК (таблица). Для систем ДСН-Se⁰ и П(ВП-КС)-Se⁰ количество N^* адсорбированных на поверхности наночастиц селена макромолекул составило соответственно 10⁵ и 270 (таблица). При этом во всех случаях сохранялось молекулярно-дисперсное состояние растворов наносистем, о чем свидетельствовал характер зависимостей Dn =f(g): при g<g_к для всех с и g (в случае ПЭК) они хорошо аппроксимируются прямыми линиями, проходящими через начало координат [11].

Расчет величины параметра асимметрии формы частицы р^* для исследованных наноструктур в приближении [n]^*~[n]_f^* на основании соотношения (2) показал, что при g = 0.5 и 4.0 формируются наноструктуры, форма которых – сферическая (р^* = 1.0). Для наносистем ДСН-Se⁰ и П(ВП-КС)-Se⁰ величины параметра р^* составляют соответственно 1.0 и 1.2, что также характеризует форму наноструктур, как близкую с сферической [11]. Это полностью согласуется с данными по параметру r^*: r^*=1.0 (так как R_g^* = R_h^* (таблица)) для наносистем ПЭК-Se⁰ при g=0.5 и g=4.0, а также для компонентов ПЭК, что соответствует сферической конформации частицы [9].

В экспериментах по статическому и динамическому светорассеянию зафиксировано различие в величинах R_g^* и R_h^* для наноструктур ПЭК-Se⁰с различным g: R_g^* = R_h^* =40 нм (g=0.5) и R_g^* = R_h^* =60 нм (g=4.0) (таблица), т.е. большая по молекулярной массе наноструктура имеет и большие размеры (отметим, что в отсутствие селена в растворе большие значения ММ и размеров также наблюдаются для ПЭК с превосходящим содержанием ДСН [17]). Для компонентов ПЭК величины среднеквадратичных радиусов инерции R_g^* и средних гидродинамических радиусов R_h^* совпали и составили R_g^* = R_h^* = 40 нм (ДСН-Se⁰) и R_g^* = R_h^* = 50 нм (П(ВП-КС)-Se⁰) (таблица).

Расчет средней плотности наноструктуры F^* (таблица) по формуле (1) показал, что наносистема ПЭК-Se⁰ (g=4.0) оказывается существенно более плотной (F^*=0.17 г/см³), чем при g=0.5 (F^*=0.03 г/см³). Это указывает на различную упаковку и распределение органической фазы вокруг селенового ядра. Для наносистем ДСН-Se⁰ и П(ВП-КС)-Se⁰ величины средней плотности F^* (таблица) составляют соответственно F^*=0.08 и 0.03 г/см³. Таким образом, увеличение в ПЭК содержания ДСН, показывающего большую плотность в комплексе с селеном, чем сополимер, приводит к уплотнению наноструктуры.

Второй вириальный коэффициент А₂^* для наноструктуры с g=0.5 стремится к нулю (А₂^* = 0.2´10^-4 см²моль/г²), что характеризует состояние раствора как приближающееся к идеальному. Величина А₂^* для наносистемы ПЭК-Se⁰ с g=4.0 отрицательна (А₂^* = - 0.8´10^-4 см²моль/г²), что свидетельствует о плохом термодинамическом качестве раствора. Следует подчеркнуть, что при g=0.5 наличие в растворе селена практически не сказывается на его термодинамическом состоянии, в то время как при g=4.0 переход от системы ПЭК-вода к системе ПЭК-Se⁰-вода сопровождается кардинальным изменением термодинамического состояния раствора от хорошего [17] к плохому (таблица). По-видимому, в наносистеме ПЭК-Se⁰ с g=4.0 гидрофобные алкильные группы КС преимущественно ориентированы в объем растворителя (а селеновое ядро находится в окружении ДСН), что и приводит к низкому сродству этой наносистемы к воде. Для компонентов ПЭК величина второго вириального коэффициента А₂^* совпадает с величиной этого параметра для наносистемы ПЭК-Se⁰ с g=0.5 (А₂^* = 0.2´10^-4 см²моль/г²).

Таким образом, гибридные селен-полимерные наносистемы на основе полиэлектролитных комплексов катионного сополимера N-винилпирролидона и N,N,N,N-триэтилметакрилоилоксиэтиламмоний йодида с додецилсульфатом натрия с варьируемым соотношением заряженных субъединиц кардинально различаются по структурным (ММ, R_g^*, R_h^* и F^*) и термодинамическим параметрам (А₂^*). Полученные данные составляют физико-химическую основу для целенаправленного синтеза потенциальных биологически активных веществ на основе нульвалентного селена и мембранотропных агентов с пониженной токсичностью и выраженной физиологической активностью.

Литература

1. Панарин Е.Ф., Копейкин В.В. Биологическая активность синтетических полиэлектролитных комплексов на основе ионогенных сурфактантов// Высокомолек. соед. 2002. Т. 44С. № 12. С. 2340-2351.

2. Копейкин В.В., Афанакина Н.А., Фазиль Г.А., Сантурян Ю.Г. Изучение микроокружения полиэлектролитных комплексов додецилсульфата натрия в водных растворах методом спектрального сдвига красителя// Высокомолек. соед. 1987. Т. 29А. № 2. С. 370-376.

3. Валуева С.В., Боровикова Л.Н., Коренева В.В. и др. Структурно-морфологические и биологические свойства наночастиц селена стабилизированных бычьим сывороточным альбумином// Журн. физ. химии. 2007. Т.81. № 1. С.1329-1333.

4. Копейкин В.В. Влияние катионного полиэлектролита и полиэлектролитных комплексов додецилсульфата натрия на проницаемость модельных фосфолипидных мембран// Биологич. мембраны. 1988. Т.5. № 7. С. 728-734.

5. Валуева С.В., Боровикова Л.Н., Киппер А.И. Влияние соотношения компонентов комплекса селен:поливинилпирролидон на процесс формирования и морфологические характеристики наноструктур// Журн. физ. химии. 2008. Т.82. №6. С.1131-1136.

6. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. 320 с.

7. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул. Л.: Наука, 1986. 288 с.

8. Brown W. Dynamic Light Scattering: the Method and Some Application. Oxford: Clarondon Press, 1993. 305 p.

9. Burchard B.W. Laser Light Scattering in Biochemistry Eds. by Harding S.E., Satelle D.B., Bloomfild V.A. Cambridge : Royal Soc. Chem, 1992. Information Services. P.3-21.

10. Pogodina N.V., Tsvetkov N.V. Structure and Dynamics of the Polyelectrolyte Complex Formation Macromolecules// Macromolecules. 1997. V. 30. № 17. P. 4897-4904.

11. Цветков В. Н., Эскин В. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворах. М.: Наука, 1964. 720 c.

12. Handbook of Chemistry and Physics / Ed. by Lide D.R. Claveland: Chapman and Hill CRC . 2001.

13. Краткая химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 1965. Т.4 С. 779.

14. C. P. Shah, M. Kumar1 and P. N. Bajaj Acid-induced synthesis of polyvinyl alcohol-stabilized selenium nanoparticles //Nanotechnology. 2007. V. 18. p. 1-7.

15. Yogesh Patil and P. K. Khanna. Fabrication of Selenium Rods by Solution Method, Synthesis and Reactivity in Inorganic// Metal-Organic, and Nano-Metal Chemistry. 2008. V.38. Р.518–523.

16. L.A. Smith, R.B. Hammond, K.J. Roberts, D. Machin, П. McLeod Determination of the crystal structure of anhydrous sodium dodecyl sulphate using a combination of synchrotron radiation powder diffraction and molecular modelling techniques // Journal of Molecular Structure. 2000. V. 554. p. 173-182

17. Копейкин В.В., Киппер А.И. Полиэлектролитные комплексы додецилсульфата натрия и катионного сополимера винилпирролидона в водных растворах// Высокомолек. соединения. 2001. Т. 43Б. № 7. С. 1245-1250.