К.м.н. Паньков А.С.

Оренбургская государственная медицинская академия, Россия

Модификация факторов патогенности в вирусо-бактериальной

ассоциации.

 

Взаимодействие вирусов и бактерий на сегодняшний день до конца не изучено [1, 5].

Одним из актуальных вопросов инфекционной патологии является определение роли вирусо-бактериальных ассоциаций в патогенезе смешанных инфекций, в развитии бактериальных осложнений [6].

Известно, что взаимодействие между бактерией и вирусом может проявляться через модификацию факторов патогенности. Одним из основных факторов патогенности стафилококка является гемолитическая активность [4], а фактором персистенции антилизоцимная активность [3].

Известно взаимное влияние именно вируса гриппа и S. аureus, что приводит к повышению риска, инфекций вызванных  стафилококками  [10]. Это связано с тем, что  вирус   гриппа  повышает специфическую адгезию S.aureus к эпителию дыхательных путей, а протеазы  стафилококка  могут усиливать репликацию  вируса   гриппа  [11]. Этот механизм может способствовать синергидному взаимодействию вирусов и стафилококков и быть причиной более тяжелого течения сочетанной инфекции. Штаммы вируса гриппа снижают фагоцитарный киллинг S.aureus, приводя к повышенной агрессии патогена [9].

Цель исследования – изучить изменения свойств вируса гриппа и S. au-reus в условиях сокультивирования.

Материалы и методы

Было изучено 40 штаммов S. aureus, выделенных со слизистой оболочки носа и слизистой оболочки миндалин больных гриппом людей. Выделение и идентификацию S. aureus проводили по общепринятым схемам, используя тест-системы фирмы «Lachema» (Чехия) [7]. У выделенных микроорганизмов S. aureus были определены гемолитическая (ГА) [2], лизоцимная (ЛА) и антилизоцимная (АЛА) активности чашечным методом [3].

Забор материала на вирусологическое исследование производился со слизистой оболочки носа больных гриппом людей. Выделение и идентификацию вируса гриппа проводили согласно методическим рекомендациям [7]. Выделение вирусов производилось на клеточной культуре MDCK. От обследованных больных в период экспериментального исследования (III-2010 – VI-2010) было выделено 3 штамма вируса гриппа В. Вирус гриппа А в данный период не выделялся.

Для изучения модификации свойств вируса гриппа и S. aureus в условиях сокультивирования использована экспериментальная модель вирусо-бактериальной ассоциации в культуре клеток (заявка на патент № 2011117801).

Для количественного определения концентрации вируса гриппа в эксперименте был использован метод ПЦР в режиме реального времени аппаратом Rotor Gene 6000.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Biostat», «Statistica 6,0», «SPSS 11.0».

 

Результаты и обсуждение

После соинкубирования S. aureus и вируса гриппа у золотистого стафилококка были изучены интенсивность роста, а также экспрессия факторов патогенности и персистенции: ГА, ЛА, АЛА.

Интенсивность роста оценивался на чашках Петри по числу выросших колоний стафилококков: в опыте - после ассоциации с вирусом гриппа, в контроле – без ассоциации с вирусом гриппа.

При оценке абсолютных показателей роста S. aureus, в присутствии вируса гриппа и без вируса гриппа, обращает на себя внимание следующий факт, что число выросших колоний S. aureus на чашке Петри после соинкубирования с вирусом гриппа в 3 раз больше, чем число колоний S. aureus без соинкубирования с вирусом гриппа (Nсредн.= 411±6,1 колоний против Nсредн.= 126±4,5 колоний, p<0,05).

Распространенность гемолитической активности S. aureus в опыте в 2,7 раза была больше, чем в контроле (55,0±12,8 % против 20,0±10,3 %, при p<0,05), а уровень экспрессии в 2,7 раза выше (1,9±0,4 мм против 0,7±0,3 мм, при p<0,03).

Экспрессия лизоцимной активности S. aureus в опыте была в 3,6 раза выше, чем в контроле (1,8±0,3 мм против 0,5±0,2 мм, p<0,05), а распространенность ЛА в 5 раз выше у штаммов S. aureus, после соинкубирования с вирусом гриппа (45,0±8,6 % против 8,3±3,9%, p<0,05).

Антилизоцимный признак у S. aureus в опыте имел высокую экспрессию признака (в 4,4 раза больше) по сравнению с контролем (3,5±0,4 мкг/мл против 0,8±0,4 мкг/мл, при p<0,01), распространенность АЛА была в 3,3 раза больше (73,3±11,4 % против 22,2±12,5 %, при p<0,01).

У вируса гриппа после соинкубирования с S. aureus были определены способность агглютинировать эритроциты и цитопатическое действие, а также количественное определение концентрации вируса путем подсчета циклов амплификации методом ПЦР в режиме реального времени.

Вирус гриппа агглютинировал эритроциты в разведениях от 10-1 до 10-2. В опыте в присутствии S. aureus вирус гриппа агглютинировал эритроциты в большем разведении - до 10-4.

Полное разрушение культуры клеток под действием вируса в монокультуре происходило на 6 день инкубирования. В опыте в присутствии S. aureus цитопатическое действие вируса полностью происходило на 2 дня раньше.

Для количественного определения концентрации вируса гриппа в эксперименте был использован метод ПЦР в режиме реального времени аппаратом Rotor Gene 6000. Результаты представлены.

Как видно из рисунка 3 вирус гриппа после соинкубирования с S. aureus регистрировался на 15-17 циклах амплификации, а в контроле (без инкубации с S. aureus) только с 21 цикла, что свидетельствовало о более быстром накоплении вируса гриппа под влиянием S. aureus. 

Приведенные данные показали, что в клеточной культуре вирус гриппа стимулирует рост S. aureus и усиливает его факторы патогенности. При отсутствии вируса гриппа в культуре клеток рост S. aureus заметно ниже, факторы патогенности проявляются слабее.

У вируса гриппа вследствие взаимодействия с S. aureus усиливается способность агглютинировать эритроциты в 2 раза, а также усиливается цитопатическое действие, которое проявляется сокращением жизнеспособности культуры клеток на 2 дня, кроме того концентрация вируса гриппа также увеличивается.

Данные результаты показывают взаимное влияние вируса гриппа и      S. aureus, что в итоге сказывается на клеточной культуре в виде усиления цитолиза. Можно предположить, что, потенцируя действие друг друга, вирус гриппа и S. aureus отягощают течение гриппозной инфекции и развитие бактериальных осложнений.

Изучение закономерностей формирования вирусо-бактериальной ассоциации поможет расшифровке новых звеньев в механизме симбиотических взаимоотношений. Включение в симбиоз вирусов и бактерий может иметь разные последствия для гомеостаза хозяина, определять результат течения инфекционного процесса.

 

 

 

 

 

 

Литература.

1.     Беляева Е.В., Борискина Е.В., Ермолина Г.Б. и др. Исследование персистентных свойств микрофлоры респираторного тракта больных хроническими неспецифическими заболеваниями нижних дыхательных путей // Медицинский альманах. – 2010. - № 2. - С. 266-269.

2.     Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. – М.: Медицина, 1982. - 462с.

3.     Бухарин О. В. Антилизоцимный признак бактерий и перспективы его практического использования // Персистенция микроорганизмов / Под ред. О. В. Бухарина. Куйбышев, 1987. - С. 4—10.

4.     Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Чернова О.Л. Биология патогенных кокков. - Екатеринбург: УрО РАН. - 2002. -282 с.

5.     Гудима И.А. Микробные биоценозы при гипертрофии лимфоидного кольца глотки и хроническом тонзиллите у детей. Автореф. дис. канд. Ростов-на-Дону, 2002.

6.     Колобухина Л.В. Клиника и лечение гриппа. // Русский медицинский журнал.– 2001. - № 9. – С. 16 - 17.

7.     Методические рекомендациями по выделению и идентифи­кации бактерий рода Staphylococcus. - Москва, 1990.

8.     Методические рекомендации «Выделение вируса гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация». – СПб., 2006.

9.     Abramson J.S., Lewis J.C., Lyles D.S. et al. Inhibition of neutrophil lysosome-phagosome fusion associated with influenza virus infection in vitro. Role in depressed bactericidal activity // J. Clin. Invest. – 1982. – Vol. 69. – P. 1393–1397.

10. Nickerson C.L., Jakab G.J. Pulmonary antibacterial defenses during mild and severe influenza virus infection // Infect. Immun. – 1990. – Vol. 58. – P. 2809–2814.

11. Sanford B.A., Ramsay M.A. Bacterial adherence to the upper respiratory tract of ferrets infected with influenza Avirus // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1987. – Vol. 185. – P. 120–128.