Химия и химические технологии/ 4.Химико-фармацевтическое производство.

Оспанов Е.С , Арыстанова Т.А., Ирисметов М.П , Джиембаев Б.Д.

Южно-Казахстанская государственная медицинская академия, Казахстан

Институт химических наук МОН РК им. А.Бектурова, Казахстан

Новое полусинтетическое производное компонента корня солодки: получение и стандартизация

Поиск новых высокоэффективных лекарственных препаратов с минимальными побочными реакциями является одним из основных направлений исследований ученых, работающих в области медицины и фармации. Возможность существенного снижения побочных реакций появляется при использовании субстанций, выделенных из лекарственных растений, причем биологическая активность многих из них значительно превышает таковую синтетических лекарственных средств. В этом плане большой интерес представляет Glycyrrhiza glabra (Солодка голая) как источник биологически активных веществ, обладающих широким спектром фармакологической активности.

На основе экстрактивных веществ, полученных из корня солодки – глицирризиновой, глицирретовой кислот и их производных, созданы лекарственные препараты с высокой фармакологической активностью стероидных средств, но лишенные специфических и нежелательных побочных эффектов последних. Отечественными и зарубежными учеными исследованы противовоспалительное, анальгезирующее, антигистаминное, ранозаживляющее и дезинтоксикационное свойства глицирретовой кислоты (ГЛК), являющейся агликоном глицирризиновой кислоты (ГК) [1,2].

В Казахстане в Институте химических наук МОН РК им. А.Б. Бектурова совместно с кафедрой фармацевтической и токсикологической химии ЮКГМА на протяжении многих лет исследуются биологически активные компоненты солодкового корня, большое количество работ посвящено изучению химической структуры, физических, химических и фармакологических свойств действующих веществ солодки, получены их полусинтетические производные [3-6].

Целью исследования является разработка способа получения и контроль качества аммонийной соли глицирретовой кислоты (I) как лекарственной субстанции.

Материалы и методы. В работе использованы лабораторные образцы субстанции (I), образцы ГК, ГЛК, полученные в филиале лаборатории ХПС ИХН МОН РК при АО «Химфарм». Для получения глицирретовой кислоты (ГЛК) из глицирризиновой кислоты (ГК) использован густой экстракт корня солодки (ГФ X, ст.261) производства АО «Химфарм». Для анализа I использованы растворители, растворы, реактивы категории ч.д.а. Исследование хроматографического поведения проводилось на пластинках «Сорбфил» (10х10, 10х15, Россия), «Кизельгель 254/366» (20х20, «Merk», Германия). Пробы на пластинки наносились с помощью микрошприцев (МШ, Россия) и микрокапиляров 2 мкл (Россия). УФ-спектры регистрировались на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) в диапазоне длин волн 200-400 нм, в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Получение глицирретовой кислоты (ГЛК).

1.Гидролиз глицирризиновой кислоты. В колбу помещают 50 г густого экстракта корня солодки и заливают 100 мл воды, перемешивают 10-15 минут, затем осторожно добавляют 36 мл кислоты хлороводородной (концентрация кислоты хлороводородной в растворе экстракта 7,5- 8 %). Полученную смесь нагревают до 100°С и кипятят при этой температуре 3 часа. Реакционную массу охлаждают до 20-25°С и фильтруют. Осадок фильтруют, промывают до нейтральной реакции, сушат при температуре 60°С в течение 15 часов. Выход продукта - глицирретовой кислоты составляет 70-75%.

2. Получение очищенной глицирретовой кислоты. В колбу помещают 100 мл хлороформа, 5 г неочищенной глицирретовой кислоты, 1,5 г угля активированного. Колбу устанавливают на магнитную мешалку и экстрагируют при комнатной температуре 2 часа. По окончании экстракции реакционную смесь фильтруют, экстракт упаривают до 10 мл, отфильтровывают и сушат при температуре 60°С в течение 2-х часов. Выход продукта составляет 90-95%.

3. Получение аммонийной соли глицирретовой кислоты:

I способ. В колбу, снабженную обратным холодильником, помещают 1 г кислоты глицирретовой , приливают 50 мл метанола, нагревают на водяной бане до полного растворения кислоты глицирретовой. Затем в колбу вносят 1 г мелкорастертого двууглекислого аммония, и продолжают нагревание колбы с обратным холодильником на водяной бане в течении 2-х часов. Затем фильтруют, фильтрат упаривают досуха. Выход не менее 90%.

II способ. В колбу, снабженную обратным холодильником, помещают 1 г кислоты глицирретовой , приливают 50 мл метанола, нагревают на водяной бане до полного растворения кислоты глицирретовой. После растворения кислоты глицирретовой однородный прозрачный раствор переносят в двугорлую колбу, снабженную хлоркальциевой трубкой и барбатируют (пропускают через раствор газообразный аммиак) 30-40 минут. Затем выпаривают растворитель. Контроль за окончанием синтеза проводят с помощью метода тонкослойной хроматографии.

По результатам исследования 5 серий лабораторных образцов, для I характерно описание внешнего вида, как кристаллического порошка светло-коричневого цвета со специфическим запахом и горьковатым вкусом. Температура плавления образцов находится в пределах 231-237⁰C. Потеря в массе при высушивании составляет 4,5% ± 0,1. Разработаны методики идентификации, характерные для стероидного цикла: Либермана-Бурхарда, с кислотой серной конц., кислотой фосфорномолибденовой, кислотой фосфорновольфрамовой и определена их чувствительность.

Нами разработана методика определения посторонних примесей с помощью метода тонкослойной хроматографии.

Методика определения посторонних примесей. 0,1 г соединения I растворяют в 10 мл спирта этилового 95%. На линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил» размером 15х15 см наносят 5 мкл (50 мкг) исследуемого раствора и 10 мкл (4 мкг) 0,04%-ного раствора СОВС глицирретовой кислоты. Пластинку с нанесенными пробами подсушивают на воздухе в течение 10 минут, помещают в камеру с подвижной фазой и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей достигнет 12 см, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе до полного исчезновения запаха растворителей и просматривают в УФ- свете.

На хроматограмме испытуемых растворов, кроме основного пятна, допускается наличие дополнительного пятна, не превышающего по размеру и интенсивности флуоресценции пятна СОВС (не более 8%).

Учитывая чувствительность обнаружения в УФ-свете I и возможных примесей в количестве 1 и 0,5 мкг для нормирования предела содержания примесей в количестве стандартного образца вещества свидетеля (СОВС) использовали сам препарат в количестве 4 мкг, что составляет 8 % от его количества в наносимой пробе (50 мкг).

Изучение спектральных характеристик аммонийной соли глициррретовой кислоты в УФ-области спектра позволило использовать спектрофотометрический метод, как наиболее достоверный и доступный для количественного анализа.

Методика количественного определения. Около 0,05 г (точная навеска) I помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 25 мл спирта этилового 50%, доводят объем раствора растворителем до метки и перемешивают. 4 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре при длине волны 251±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 50%.

Содержание I в препарате в пересчете на сухое вещество в процентах (Х,%) вычисляют по формуле:

Х=	D * 50 * 100 * 100
	193,7 * 4 * m * (100 – W )

где: D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса навески вещества, взятая для анализа, г; 193,7- удельный показатель поглощения I при длине волны 251 нм; W- потеря в массе при высушивании, %.

Результаты и обсуждение. Разработан способ получения водорастворимой аммонийной соли глицирретовой кислоты, который характеризуется простотой выполнения, позволяющий получить стабильный целевой продукт с выходом не менее 90%.

С целью выбора оптимальных оптимальных условий разделения I и возможных посторонних примесей изучено их хроматографическое поведение на пластинках «Сорбфил» и «Кизельгель». Выбраны следующие условия хроматографирования: пластинки «Сорбфил», подвижная фаза н-бутанол-этанол-аммиак (25:10:15), детектирование зон адсорбции в УФ- свете (предел обнаружения 5γ). В этих условиях селективно делятся ГК (R_{f ~}0,35), I (R_{f ~} 0,53). В качестве СОВС использована ГЛК, полученная в филиале лаборатории ХПС ИХН МОН РК при АО «Химфарм». Нормировано содержание посторонних примесей не более 8%.

Изучены спектральные характеристики I в зависимости от рН среды. Наиболее характерные спектры получены в нейтральной среде, растворитель этанол 50%. Величина удельного показателя поглощения I в точке максимума при 251 нм составляет 194±2 нм. Подчинение основному закону светопоглощения в пределах концентраций изучаемых соединений 0,001-0,004 мг/мл. Рабочая концентрация 0,002 мг/мл.

Определены валидационные характеристики разработанной методики количественного определения I: линейная зависимость, удовлетворительность, воспроизводимость. Подчинение основному закону светопоглощения наблюдается в диапазоне ±30 % от исследуемой концентрации I, коэффициент корреляции при этом составил 0,9997. Правильность методики определена по результатам трехразового определения 7 аналитических концентраций модельных смесей с использованием лабораторных образцов I. Средний процент регенерации составляет 90,8%. При проведении индивидуальных многократных определений концентраций I в исследуемых растворах наблюдалось достоверное совпадение результатов. Величина стандартного отклонения среднего результата составляет 1,56%, которая характеризует хорошую воспроизводимость разработанной методики.

Вывод: Разработан способ получения аммонийной соли глцирретовой кислоты. Изучены физические и химические свойства полученного соединения, разработаны методики идентификации, оценки качества по показателям «посторонние примеси» и «количественное определение», которые легли в основу проекта Временной фармакопейной статьи.

Литература:

1. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Сердюк Н.Г. Глицирретовая кислота // Хим.-фарм.журнал.-1998.-№8.-С.5-14

2. Толстиков Г.А., Джиембаев Б.Ж., Сегал А.Р. Синтетические превращения глицирретовой и 18-дегидроглицирретовой кислот как путь к получению физиологически активных веществ // В кн.: Технология возделывания, переработка лекарственного сырья и производство препаратов для медицины.- Алматы.-РНИ Бастау.-1997. 129 с.

3. А.С. 1098246. СССР. Метиловый эфир 18β-3-аминоглицирретовой кислоты, обладающий бактерицидной активностью / Толстиков Г.А., Ирисметов М.П., Шигаева Н.Х. и др.; опубл. 1998, Бюл. №7.

4. Ирисметов М.П., Джиембаев Б.Ж., Сегал А.Р. и др. Производные глицирретовой кислоты как антифлогистики // В кн.: Технология возделывания, переработка лекарственного сырья и производство фитопрепаратов для медицины и сельского хозяйства. - Алматы, 1997. - С.128.

5. Арыстанова Т.А, Ирисметов М.П., Джиембаев Б.Ж., Ордабаева С.К., Дуйсебаева С.С. Способ получения нового полусинтетического производного глицирретовой кислоты // Материалы международной научно-практической конференции «The science: theory and practice». – Vol.33 Chemistry and chemical technologies. - Днепропетровск, 2005. - С.8-13.

6. Махова Е.Г., Арыстанова Т.А, Ирисметов М.П., Джиембаев Б.Ж. Синтез и стандартизация нового производного 18-дегидроглицирретовой кислоты //Химический журнал Казахстана. Спец. выпуск –Т.16 – Алматы, 2007. - С.214-218.