Химия и химические технологии/ 4.Химико-фармацевтическое производство.

Арыстанова Т.А., Адеханова К.К., Шукирбекова А.Б.

Южно-Казахстанская государственная медицинская академия, Казахстан

Валидационные характеристики методики анализа активных компонентов капсул «Биосанто»

В процессе подготовки нормативной документации на новое комбинированное лекарственное средство с антигельминтной активностью в виде капсул «Биосанто» нами разработана методика количественного определения активных компонентов препарата методом УФ - спектрофотометрии. Капсулы «Биосанто» созданы на основе сочетания сесквитерпена полыни цитварной - сантонина и биосластилина (БС) - сухого экстракта корня солодки с содержанием не менее 80% глицирризиновой кислоты (ГК) [1,2].

Одним из современных требований к аналитической методике является доказательство валидности, т.е. гарантии, что разработанная методика обеспечивает воспроизводимые и достоверные результаты [3].

В связи с этим задались целью изучить валидационные характеристики разработанной методики количественного определения активных компонентов капсул «Биосанто».

Материалы и методы. В работе использованы лабораторные образцы субстанции сантонина, биосластилина (ВФС РК 42-349-2000), полученные в лаборатории филиала Института химии природных соединении МОН РК при АО «Santo»; все растворы реактивов и растворители категории ч.д.а. приготовлены в соответствии с ГФ ХІ. Спектры поглощения регистрировались на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ «Спектр», Россия) в диапазоне длин волн от 200 до 350 нм.

УФ-спектры биосластилина (по основному действующему веществу - кислоты глицирризиновой) изучены и используются для идентификации, количественного определения его в индивидуальных лекарственных формах по собственному поглощению в УФ-области спектра [2]. УФ-спектры сантонина были изучены нами ранее и освещены в работе [4]. Для них характерны следующие оптические характеристики: раствор сантонина в хлороформе имеет максимум поглощения при длине волны 240 нм, рабочая концентрация 0,001%, удельный показатель поглощения 517,5; раствор биосластилина в растворе аммония гидроксида 0,25% в спирте этиловом 50% имеет максимум поглощения при длине волны 252 нм, рабочая концентрация 0,004%, удельный показатель поглощения 135,4.

Однако при их совместном присутствии такое определение становится невозможным, поскольку спектры поглощения кислоты глицирризиновой и сантонина накладываются друг на друга.

Поэтому нами предлагается предварительное разделение активных компонентов препарата друг от друга в зависимости от их физических свойств. Для этого препарат растворяют в хлороформе, при этом кислота глицирризиновая остается в осадке ввиду своей нерастворимости, а сантонин переходит в фильтрат.

Методики определения. Сантонин. Навеску препарата 0,1 г (точная навеска) растворяют в 10 мл хлороформа и фильтруют, фильтр промывают с 5 мл хлороформа. Фильтрат переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем доводят до метки хлороформом (Раствор А).

В мерную колбу вместимостью 50 мл берут 0,5 мл из раствора А, доводят объем до 50 мл хлороформом. Раствор Б.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 240 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) сантонина. В качестве раствора сравнения используют хлороформ.

Содержание сантонина Х в одной капсуле в граммах вычисляют по формуле:

Д₁ × m₀ × 50 × 0,5 × 50 b Д₁ × m₀ × b

Х= =

Д₀ × m × 50 × 0,5 × 50 Д₀ × m

где Д₁ – оптическая плотность испытуемого раствора;

Д₀ – оптическая плотность раствора РСО сантонина;

m₀ - масса навески РСО сантонина в г;

m – масса навески препарата в г;

в – средняя масса капсулы, г;

b – средняя масса одной капсулы в г.

Содержание сантонина в одной капсуле должно быть не менее 0,095 г, считая на среднюю массу одной капсулы.

Примечание. Приготовление раствора РСО сантонина. Около 0,05г (точная навеска) сантонина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в хлороформе. Объем раствора доводят до метки тем же растворителем, перемешивают (раствор А).

0,5 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем до метки хлороформом (раствор Б).

Кислота глицирризиновая. Осадок в фильтре промывают 0,25% раствором аммиака в спирте этиловом 50% и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем доводят до метки этим же растворителем. Раствор А.

В мерную колбу вместимостью 50 мл берут 2 мл из раствора А, объем доводят спиртом этиловым 50%. Раствор Б.

Оптическую плотность полученного раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 252 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора рабочего стандартного образца (РСО) кислоты глицирризиновой. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 50%.

Содержание кислоты глицирризиновой Х в одной капсуле в граммах вычисляют по формуле:

Д₁ × m₀ × 50 × 2 × 50 b Д₁ × m₀ × b

Х= =

Д₀ × m × 50 × 2 × 50 Д₀ × m

где Д₁ – оптическая плотность испытуемого раствора;

Д₀ – оптическая плотность раствора РСО кислоты глицирризиновой;

m₀ - масса навески РСО кислоты глицирризиновой в г;

m – масса навески препарата в г;

в – средняя масса капсулы, г;

b – средняя масса одной капсулы в г.

Содержание кислоты глицирризиновой в одной капсуле должно быть не менее 0,08 г, считая на среднюю массу одной капсулы.

Примечание. Приготовление раствора РСО кислоты глицирризиновой. Около 0,05 г (точная навеска) кислоты глицирризиновой помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в растворе аммония гидроксида 0,25% в спирте этиловом 50%. Объем раствора доводят до метки тем же растворителем, перемешивают (раствор А).

2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем до метки спиртом этиловым 50% (раствор Б).

Результаты и обсуждение. Изучение валидационных характеристик проводилось по таким параметрам, как специфичность, линейная зависимость, правильность и воспроизводимость. Специфичность метода основана на возможности достоверно определять количественное содержание сантонина и БС в капсуле ввиду характерных для каждого препарата электронных спектров поглощения в УФ и видимой областях спектра. Тождественность активных компонентов капсулы сантонина и БС (по кислоте глицирризиновой) подтверждалась совпадением максимумов и минимумов поглощения анализируемых образцов таковым соответствующих РСО препаратов при оптимальном подборе условий спектрофотометрирования.

Линейная зависимость метода характеризует способность получения аналитических сигналов в виде оптической плотности, прямо пропорциональных содержанию анализируемых веществ в испытуемом образце. Линейность исследовалась на модельных смесях в интервале 70-130% от заявленного содержания сантонина и БС в капсуле. При статистической обработке линейной зависимости по уравнению типа y=bx+a коэффициент корреляции линейного регрессионного графика r для сантонина составляет 0,9997 при коэффициенте регрессии 0,04089, для БС – 0,9996 и 0,01358 соответственно. На основании полученных результатов можно утверждать о соблюдении линейности для активных компонентов капсулы в интервале 70-130%, который определяется как аналитическая область методики.

Таблица 1

Оценка линейной зависимости

Препарат, С, мкг/мл	D	Е^1%1см	Е^1%1см, ср.	r
Сантонин 4 6 8 10 12 14 16	0,0430 0,1350 0,2830 0,3570 0,4650 0,5530 0,6530	215,0 337,5 471,6 446,2 465,0 460,8 466,4	408,9	0,9997
Кислота глицирризиновая 32 34 36 40 42 44 46	0,4313 0,4643 0,4903 0,5414 0,5704 0,5981 0,6275	134,7 136,5 136,1 135,3 135,8 135,9 136,4	135,8	0,9996

Правильность методики установлена по результатам анализа модельных смесей с использованием стандартных образцов для трехразового определения 7 аналитических концентраций. Средний процент регенерации составляет для сантонина 99,4%, для кислоты глицирризиновой в БС - 80,6%. Результаты исследования, представленные в таблице 2, показывают удовлетворительную точность методики.

Таблица 2

Оценка удовлетворительности методики

Количество активных компонентов от заявленного, %	Состав модельной смеси, г		Найдено, г		Регенерация, %
	С	ГК	С	ГК	С	ГК
70	0,0700	0,0700	0.0698	0,0545	99,8	77,8
80	0,0800	0,0800	0,0796	0,0626	99,5	78,3
90	0,0900	0,0900	0,0904	0,0718	100,4	79,8
100	0,1000	0,1000	0,0992	0,0814	99,2	81,4
110	0,1100	0,1100	0,1085	0,0887	98,7	80,6
120	0,1200	0,1200	0,1175	0,0970	97,9	80,8
130	0,1300	0,1300	0,1301	0,1113	100,1	85,6
Среднее значение					99,4	80,6

Примечание: С – сантонин, ГК – глицирризиновая кислота

Воспроизводимость аналитической методики характеризовалась степенью совпадения результатов индивидуальных определений при многократном использовании. Относительная ошибка среднего результата для сантонина составляет 1,17%, для БС – 1,75%. По данным параметрам (величины стандартного отклонения) можно сделать заключение о хорошей воспроизводимости разработанной методики, представленной в таблице 3.

Таблица 3

Оценка воспроизводимости методики

Хi, г	n	хср	S	∆хср	Pf	хср±∆хср	εср,%
По сантонину 0,0955 0,0957 0,0977 0,0964 0,0970 0,0973 0,0953	7	0,0964	0,0009	0,001	2,45	0,0964±0,001	1,17
По кислоте глицирризиновой 0,0805 0,0790 0,0774 0,0801 0,0785 0,0773 0,0803	7	0,0791	0,001	0,001	2,36	0,0791±0,001	1,75

Выводы. По результатам валидации установлено, что разработанная методика является специфичной для определения сантонина и БС в капсулах «Биосанто» при взаимном присутствии, характеризуется корректной точностью и воспроизводимостью, линейной зависимостью в аналитической области ±30% по отношению к заявленному содержанию действующих веществ в препарате, что позволяет использовать ее для достоверной оценки качества препарата.

Литература:

1. Арыстанова Т.П. Стандартизация лекарственных препаратов корня солодки. – Шымкент, 2001. - С.11-57.

2. Адеханова К.К., Шукирбекова А.Б. Качественный и количественный анализ активных компонентов капсул «Биосанто». – Вестник Авиценны, Душанбе 2006, №1-2. – С.277-283.

3. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация фармакопейных методов (проект общей фармакопейной статьи) // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств.-МЗ РФ.-2001.-С.28-29

4. Адеханова К.К. Метод спектрофотометрии в анализе сантонина. – Вестник ЮКГМА, 2005, №1-2 (22).- С.172-174.