Биологические науки/ Микробиология

К.б.н. Колодязная В.А., к.б.н. Топкова О.В.

ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фавмацевтическая академия, Россия

Роль продуктов гидролиза крахмала в биосинтезе ингибитора    α-глюкозидаз – антидиабетического средства гипоглюкина

         Сахарный диабет в наше время приобрел эпидемический характер, являясь одной из наиболее частых причин инвалидности и смертности. Он входит в первую триаду в структуре болезней взрослого населения: рак, склероз, диабет. Среди тяжелых хронических заболеваний у детей сахарный диабет также занимает третье место, уступая пальму первенства бронхиальной астме и детскому церебральному параличу.

         Число больных диабетом во всем мире составляет 120 млн. (2,5% населения). Каждые 10-15 лет количество больных удваивается. Наиболее тяжелым является инсулинозависимый диабет (I типа). В действительности число больных в 2-3 раза больше за счет скрытых недиагностированных форм. В основном, это относится к диабету II типа, составляющего 85-90 процентов всех случаев диабета [1].

         Для лечения диабета II типа (инсулиннезависимого) предлагается создание новых препаратов на основе ингибиторов α-глюкозидаз, образуемых микроорганизмами. В ранее опубликованных работах приведены сведения о новом, выделенном из почвы, продуценте  ингибитора α-глюкозидаз [2],  приведены данные о его структуре, характеристики химического состава и свойств по сравнению с препаратом "Акарбоза" фирмы Bayer [3].

         Продуцентом нового  ингибитора α-глюкозидаз является Streptomyces sp. шт. К-20, а препарат получил название гипоглюкин [4,5]. В данной работе приводятся сведения о влиянии источников углеводного питания на образование ингибитора в процессе развития продуцента Streptomyces sp.

         Известно, что сведения о биохимических изменениях основных элементов питательной среды, вовлеченных в метаболизм клетки можно получить, анализируя изменения в ее составе от момента внесения клетки в среду до завершения процесса ферментации [6,7]. Используя этот общепринятый метод, провели исследование динамики потребления углерода в процессе биосинтеза продуцента ингибитора α-глюкозидаз культурой Streptomyces sp. шт. К-20.

Существует определенная избирательность любого продуцента биологически активного вещества к углеводу, входящему в состав питательной среды. Как показали ранее проведенные исследования, из всех испытанных углеводов продуцент ингибитора α-глюкозидаз лучше всего растет и накапливает максимальное количество ингибитора на среде, содержащей 2% растворимого крахмала [8].

На рисунке 1 приведены данные по утилизации этого углевода культурой (общее содержание редуцирующих веществ РВ), из которых видно, что в первые  часы  ферментации  углеводы  потреблялись  из  среды  с очень  низкой скоростью. Содержание РВ на 3, 6, 12 и 18 часов роста составляло 19,5; 19,0; 18,0; 16,6 мг/мл, что соответствовало уровню РВ в исходной среде 19,5±0,5 мг/мл.

2
 

1
 

20.0 –

 

 

 

 

10.0 –

 

 

 

 
 

2
 

1
 

 3
 

6
 

9
 
                                                   

 

Рисунок 1. Содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости

                     Streptomyces sp. шт.К-20.

                     1 – ингибиторная активность, ИЕ/мл;

                         2 – содержание редуцирующих веществ, мг/мл.

 

         Такой медленный темп утилизации РВ сохранялся почти в течение суток ферментации и только, начиная с 24 часов культивирования продуцента, содержание РВ уменьшалось до значения 12,8 мг/мл,  затем резко снижаясь до 1,0 мг/мл к 96 часам роста, к моменту максимального синтеза ингибитора α-глюкозидаз.

В том случае, когда в питательной среде присутствует сложный углевод, интенсивность его утилизации наглядно демонстрирует расчет скорости потребления РВ культурой в определенный период ферментации. Эти показатели были рассчитаны для различных периодов культивирования продуцента ингибитора α-глюкозидаз и представлены в рисунке 2.

         На рисунке видно, что интенсивность потребления РВ в период 18-24 часов самая высокая, она почти в 3 раза выше, чем в начальный интервал времени 3-6 часов и 6-12 часов.

         Хорошо известно, что усвоение продуцентом крахмала происходит вследствие функционирования выделяемых им в среду амилолитических ферментов, последовательно расщепляющих макромолекулу крахмала до низкомолекулярных фрагментов (мальтоолигосахаридов, мальтозы, глюкозы), которые легко усваиваются клеткой [9.10].

 

Рисунок 2. Скорость потребления РВ в процессе ферментации

                                 Streptomyces sp. шт. К-20

 

Для каждого продуцента для роста и биосинтеза целевого продукта необходим свой оптимальный состав продуктов расщепления крахмала, который определяется биологическими особенностями продуцента и специфичностью действия собственных амилаз культуры.

Проведена оценка содержания внеклеточных амилаз а процессе культивирования продуцента ингибитора ингибитора α-глюкозидаз культурой                                 Streptomyces sp. шт. К-20 (рис. 3). Содержание этого фермента определяли в первые часы ферментации с малым интервалом времени (3, 6, 9 и 12 часов), поскольку именно в этот период скорость утилизации РВ (т.е. крахмала) была очень низкой.

2
 

1
 
 


1
 

9
 

6
 

3
 

3000 –

 

 

2000 –

 

 

1000 –

 
 

 
 

2
 

Рисунок 3. Изменение амилолитической активности ферментов

                      при биосинтезе продуцента ингибитора α-глюкозидаз

                    1- амилолитическая активность на среде с крахмалом растворимым, АЕ/мл

                        2- ингибиторная активность, ИЕ/мл

         Как следует из представленных данных, уже с 3-х часов роста продуцента в крахмалосодержащей среде начиналось накопление амилаз в культуральной жидкости (0,8 АЕ/мл) и затем их активность резко возрастала до максимально высоких значений (8,0 АЕ/мл)  на 24 часа ферментации. В этот же период ферментации скорость утилизации РВ была наиболее высокой (рис. 2). Далее с 24 часов культивирования продуцента происходило постепенное уменьшение активности амилолитических ферментов, снижаясь до минимального значения 0,3 АЕ/мл на 96 часов роста, т.е. к моменту полного исчерпания углеводов из среды (рис. 1). Именно в этот период ферментации происходит интенсивный синтез ингибитора α-глюкозидаз.

         Значительная активация собственных амилаз у продуцента ингибитора α-глюкозидаз, особенно в первые часы ферментации, предполагает, что в этот момент происходит расщепление крахмала до низкомолекулярных фрагментов, активно потребляемых актиномицетом.

         В связи с этим, представляло интерес провести хроматографический    анализ продуктов расщепления крахмала растворимого, содержащегося в среде, под действием собственных амилаз продуцента Streptomyces sp. шт. К-20 в     течение всего процесса ферментации.

Тонкослойную хроматографию проводили на готовых к употреблению пластинках с закрепленным слоем селикагеля Gel 60 F254  фирмы Merck Silica в системе растворителей изопропанол – этилацетат - вода в соотношении 7:1:2. На хроматограммы в качестве свидетелей наносили стандартные растворы мальтозы и глюкозы фирмы «Chalbiochem» в различных концентрациях. Для обнаружения пятен углеводов пластинку обрабатывали 2% раствором          2,3,5-трифенилтетразолия в спирте. Идентификацию пятен проводили на сканирующем денситометре, который позволяет подсчитать площадь пятна, занимаемую соответствующим сахаром (сканирующий спектрофотометр High speed TLC scanner CS-920 фирмы Shimadzu) при длине волны 490 нм.

Для количественного определения концентраций сахаров в культуральной жидкости использовали компьютерную программу Super Calk. При выполнении вычислений использовали стандартную программу линейной регрессии для персональных компьютеров. Данные представлены на копии хроматограммы (рис.4) и в таблице  1. 

 

 

        

 

 


         

          1       2       3        4         5        6       7       8          9       10       11       12      13     14      15      16     17      18

 

Рисунок 4. Копия хроматограммы продуктов гидролиза крахмала растворимого под действием собственных амилаз Streptomyces sp. шт. К-20

      1 – исходная ферментационная питательная среда

   2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 – культуральная жидкость на 3,6,9,12,18,24,30,48,72,96 ч ферментации

   12,13,14,15 – стандартные растворы мальтозы в концентрации  2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 мкг

   16,17,18 - стандартные растворы глюкозы в концентрации 1,0;2,0 и 3,0 мкг

             

         Таблица 1

Содержание мальтозы в культуральной жидкости Streptomyces sp. шт. К-20

Время фер-ментации, час

0

3

6

9

12

18

24

48

72

96

Количество мальтозы,мг/мл

0,0116

0,0099

0,0097

0,0096

0,0087

0,0087

0,0087

0,0054

0,0010

0,0003

 

Анализ хроматограм и данных, представленных в таблице  1, показал, что в исходной ферментационной среде, содержащей 2% растворимого крахмала, после ее стерилизации крахмал уже частично гидролизуется. В нем при общем содержании редуцирующих веществ, равном 19,5±0,5 мг/мл, содержались в основном декстрины, 0,0116 мг/мл мальтозы (М) и следы глюкозы. Наличие большого количества декстринов подтверждено качественной реакцией с йодом. Ярко-фиолетовая окраска раствора свидетельствовала о наличии в нем амилодекстринов [11].

         В первые часы ферментации (на 3 и 6 часов) в культуральной жидкости также качественной реакцией определялись декстрины. Доля мальтозы снижалась до 0,0099-0,0097 мг/мл, глюкоза тоже присутствовала в следовых количествах. Но уже с 9 часов ферментации на хроматограммах наряду с декстринами и таким же количеством мальтозы (0,0096 мг/мл), отмечали появление небольших количеств мальтотриозы (М3) и мальтотетрозы (М4), что соответствовало началу интенсивного образования амилолитических ферментов (5,0 АЕ/мл). Затем, в последующие часы ферментации (18-24 часа) в культуральной жидкости отмечали кроме декстринов наличие этих олигосахаридов (М3 и М4) несколько в большей концентрации (более интенсивная окраска пятен) и мальтозы в концентрации 0,0087 мг/мл. В этот период культивирования начинался синтез ингибитора α-глюкозидаз. Начиная с 48 часов культивирования продуцента Streptomyces sp. К-20 в культуральной жидкости качественной реакцией определялись декстрины, но мальтоолигосахариды, как видно из хроматограммы, уже отсутствовали. Присутствовала только мальтоза, количество которой уже уменьшилось до 0,0054 мкг/мл, а затем с 72 часов в культуральной жидкости оставались следовые количества этого углевода.      

         При сравнении данных, представленных на рис. 3, можно видеть, что при снижении активности амилаз в культуральной жидкости происходит и более интенсивное накопление ингибитора этих ферментов (кривая 2). По-видимому, в этот период ферментации собственные ингибиторы продуцента тормозят активность собственных амилолитических ферментов, которые расщепляют крахмал только до тех олигосахаридов, которые необходимы для синтеза конечного продукта – ингибитора α-глюкозидаз.

         Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что собственные амилазы продуцента ингибитора α-глюкозидаз Streptomyces sp. шт. К-20 проявляли преимущественно свойства α-амилаз, расщепляющих крахмал на большое количество декстринов, мальтоолигосахариды, мальтозу и следовые количества глюкозы.

         Как показали проведенные исследования, такое соотношение сахаров в гидролизатах крахмала, осуществляемое амилазами актиномицета является оптимальным и наиболее благоприятным для биосинтеза ингибитора α-глюкозидаз культурой Streptomyces sp. шт. К-20.

         Можно предположить, что мальтоза и мальтоолигосахариды, образующиеся в культуральной жидкости под воздействием собственных амилаз в процессе выращивания продуцента ингибитора α-глюкозидаз более доступны микробной клетке, чем другие сахара.

         При изучении транспортных систем углеводов в микробную клетку ряд авторов указывали на различные энергетические затраты на их фосфорилирование и перенос [12,13]. Показано, что на транспорт молекулы глюкозы затраты энергии составляют до 6 молекул АТФ, а для мальтозы всего 1 молекула АТФ, причем предпочтение при транспорте углеводов в клетку отдается более длинным цепочкам мальтозы (мальтотриозам и мальтотетрозам) [14]. Продуцент ингибитора α-глюкозидаз, образуемый  Streptomyces sp. шт. К-20, выбрал себе тот углевод, который ему легче и проще потреблять.

         При этом нельзя не отметить еще одно обстоятельство. Ранее проведенными исследованиями показано, что ингибитор α-глюкозидаз, образуемый культурой Streptomyces sp.шт. К-20, представляет собой псевдоолигосахарид [3,4].

По-видимому, в процессе ферментации актиномицета мальто-олигосахариды и мальтоза, образующиеся из крахмала под действием собственных амилаз, не только активно потребляются на рост клетки, но и участвуют как структурные единицы в синтезе самого ингибитора α-глюкозидаз.

 

Литература:

1.        Ефименко А.С. Актуальные проблемы клинической диабетологии. – Медичний Всесвiт. I.. 2001. №1. С. 14-18.

2.        Колодязная В.А. Продуцент ингибитора α- глюкозидаз, стабилизация его ингибиторной активности и изучение условий биосинтеза: Автореф. дис. на соиск. учен. ст. к.б.н.: 03.00.23.  СПб.: СПХФА, 2006. – 23 с.

3.        Акулова Н.Ю. Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства: Автореф. дис. на соиск. учен. ст. канд. биол. наук: 03.00.04.  СПб.: СПХФИ, 1993. – 20 с.

4.        Селезнева А.А., Акулова Н.Ю. Ингибиторы α-глюкозидаз микробного происхождения. // Биол. науки. - 1992, т. 2,  С. 25-31.

5.        Акулова Н.Ю., Селезнева А.А. Микробные ингибиторы α-глюкозидаз псевдосахаридной природы (обзор). // Приклад. биохим. и микробиол. - 1995. т. 31, №4, С. 371-380.

6.        Промышленная микробиология: Под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высшая школа, 1989. – 688 с.

7.        Елинов Н.П. Основы биотехнологии. С-Пб.: Наука, 1995. - 600 с.

8.        Колодязная В.А. Влияние источников углеводного питания на биосинтез гипоглюкина – нового антидиабетического средства.// Тез. докл. X Росс. науч. конгр. "Человек и лекарство", М., 2003. С. 574.

9.        Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: МГУ, 1994. – 512 с.

10.   Meneses F., Henschke P., Jiranek V. A survey of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae reveals numerous alttems of maltose and sucrose utilization. // J. Inst. Brew. 2002. Vol. 108, №3. P. 310-321.

11.   Алейников Т.Л., Рубцова Г.В.. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии.  М.: Высшая школа, 1988. – 240 с.

12.   Dills S., Apperson A., Schmidt M. and Saler J. Carbohydrate transport in bacteria. //Microbiol. Rev. 1980. Vol. 44. P. 385-418.

13.   Henderson P. The inter-relationship between protocoupled and binding protein-dependent transport system in bacteria. //Biochem. Soc. Trans. – 1980. - Vol. 8. – P. 677-679.

14.   Muir M., Williams L. and Ferenci T. Influence of Transport Energization on the Growth of Escherichia coli. //American Sosiety for Microbiology. 1985. Vol. 163. P. 1237-1242.