Коровашкина А.С., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, 220141, Минск, ул. Купревича, 2

Получение термостабильной ДНК-полимеразы с повышенной устойчивостью к цельной крови

При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) наиболее часто в качестве ДНК-полимеразы используется фермент из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-ДНК-полимераза). Однако Taq-ДНК-полимераза обладает рядом существенных недостатков. Среди них: большое количество ошибок при синтезе ДНК; высокая чувствительность к различным ингибиторам ПЦР; недостаточная термостабильность; низкая процессивность; наличие 5'→3'-экзонуклеазной активности.

В свое время была предложена KlenTaq-ДНК-полимераза (фрагмент Кленова) – «укороченная версия» Taq-ДНК-полимеразы (отсутствуют первые 279 аминокислотных остатков), лишенная 5'→3'-экзонуклеазной активности. Такой фермент более термостабилен, более точен (хотя, менее процессивен), чем Taq-ДНК-полимераза. Важной особенностью KlenTaq-ДНК-полимеразы является ее устойчивость к цельной крови (до 5–10%), в то время как нативный фермент ингибируется уже при наличии в реакционной смеси 0,1–1% крови [1].

Для преодоления некоторых из перечисленных выше недостатков ДНК-полимераз в литературе был предложен подход, основанный на получении химерных белков, включающих кроме полимеразного домена неспецифический ДНК-связывающий домен, повышающий сродство полимеразы к матрице и, как следствие, повышающий процессивность, скорость синтеза, точность функционирования, устойчивость к высокой ионной силе раствора [2–4].

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилось получение «химерной» ДНК-полимеразы с улучшенными свойствами за счет присоедине-ния к каталитическому домену KlenTaq-ДНК-полимеразы неспецифического ДНК-связывающего белка (Sso7d) бактерии Sulfolobus solfataricus.

Материалы и методы исследования. Участок гена KlenTaq-ДНК-плимеразы (KT), начинающийся с 280-го аминокислотного остатка, был выделен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК T. aquaticus. Для амплификации KT использовали следующую пару праймеров: F (5'-GAATTCCTCCTCCACGAGTTCGGCCTTC-3') и R (5'-TATGTCGACTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTCCTTGGCGGAGAGCCAGT-3'). В 5'-окончания праймеров были встроены сайты рестрикции (выделены курсивом) эндонуклеаз EcoRI (F) и SalI (R). В R-праймер также была введена последовательность, кодирующая полигистидиновый олигопептид (жирный шрифт). Синтезированный с помощью ПЦР продукт обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и SalI и клонировали в векторе pET22b+ (Novagen, США), предварительно обработанный этими же рестриктазами. В результате была получена конструкция pET22KT.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок Sso7d (ген sso7d), была получена из базы данных GenBank (№ 1453539). Оптимизацию кодонов для экспрессии белка в E. coli проводили в программе Gene Designer 2.0 (DNA 2.0, США). Дополнительно с 5'-конца гена вводили сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы NdeI, а с 3'-конца – последовательность, кодирующую линкерный олигопептид и сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRI. Дизайн олигонуклеотидов для сборки гена, кодирующего белок Sso7d, проводили с использованием программы TmPrime version 3.0 (http://prime.ibn.a-star.edu.sg/). Сборку нуклеотидной последовательности sso7d проводили с помощью ПЦР [5].

Синтезированную с помощью ПЦР нуклеотидную последовательность sso7d обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и EcoRI и встраивали в полученный ранее и предварительно обработанный этими же рестриктазами вектор pET22KT. Полученной плазмидой (pET22KT-Ssо7d) трансформировали штамм E. coli BL21(DE3). Клетки-трансформанты выращивали на LB-среде до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка 1 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 5 ч. По окончании выращивания клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ NaH₂PO₄, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазол (рН 8,0). После ультразвуковой дезинтеграции клеток лизат прогревали 30 мин при 70^оС, осветляли центрифугированием и супернатант наносили на хроматографическую колонку со смолой Ni-NTA (Qiagen, США). Выделение белка проводили согласно инструкции фирмы-производителя. Полученный раствор фермента диализовали против 1000-кратного объема буфера (10 мМ Трис-HC, рН 8,0 + 100 мМ KCl + 1 мМ ЭДТА + 2 мМ β-меркаптоэтанол + 0,5% Твин-20). Полученный после диализа препарат белка разводили в 3 раза 10 мМ Трис-HCl-буфером (рН 8,0), содержащим 100 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 0,5% Твин-20 и 50% глицерин.

Определение активности Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимеразы проводили с помощью ПЦР. Реакционная смесь (30 мкл) состояла из: синтетических олигонуклеотидов (F 5'-GTCTACCAGGCATTCGCTTCAT-3' и R 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGAT-3') (по 5 пмоль каждого), четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов (каждый в концентрации 0,2 мМ), 5 нг плазмидной ДНК, MgCl₂ (3 мМ), KCl (90 мМ), Трис-HCl, pH 8,8 (50 мМ) и 0,05% Твина-20. В реакционную смесь вносили по 1 мкл двукратных разведений очищенной Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимеразы. Программа амплификации: 2 мин 95^оС, (15 с 95^оС; 15 с 65^оС; 30 с 72^оС) – 30 циклов. Затем 3 мкл ПЦР-смеси вносили в 200 мкл 10-кратного интеркалирующего красителя Sybre green (Sigma, США), разведенного в 1660 раз ТЕ-буфером, и измеряли флуоресценцию с помощью прибора Qubit fluoro-meter (Invitrogen, США). За 1 ед. активности Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимеразы принимали такое ее количество, которое по флуоресценции соответствовало 1 ед. коммерческого препарата Taq-ДНК-полимеразы (Sileks, Россия).

Результаты исследования. Из литературных источников известно, что Sso7d-домен позволяет значительно улучшить сродство ДНК-полимеразы к матрице и, как следствие, повысить процессивность, скорость синтеза, устойчи-вость к высокой ионной силе и различным ингибиторам [4]. Основываясь на этих данных, мы предположили, что полученная химерная ДНК-полимераза будет также более устойчива к ингибированию цельной кровью.

Для определения устойчивости Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимеразы к цельной крови мы провели проверку наличия точечной мутации в гене, кодирующем фактор свёртываемости крови V (фактор Лейдена). Как известно, мутация G1691→A в этом гене приводит к повышению риска развития тромбоэмболии вен у гетерозигот в 8 раз, у гомозигот – в 80–100 раз [6]. Хотя только 5% здорового населения являются носителями мутантного аллеля, рассматриваемая мутация присутствует у 40% пациентов с диагнозом тромбоз вен. Таким образом, своевременное выявление данной мутации необходимо для правильной постановки диагноза и назначения адекватного лечения.

Для проверки влияния ЭДТА-стабилизированной крови на ПЦР, проводимой при помощи полученной нами Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимеразы, кровь здоровых доноров вносили в различных концентрациях (1–20%, v/v) в реакционную смесь. Для амплификации участка гена, кодирующего фактор Лейдена [6], использовали синтетические олигонуклеотиды (F 5'-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA-3' и R 5'-TGTTATCACACTGGTGCTAA-3').

Из электрофореграммы (рис. 1) видно, что полученный нами ампликон имеет размер приблизительно равный 267 п.о., что соответствует теоретически-рассчитанному. Таким образом, можно сделать вывод, что Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимераза проявляет высокую ферментативную активность даже при повышенных концентрациях цельной крови (до 20%).

Наличие мутации определяли при помощи обработки полученных при амплификации проб с применением эндонуклеазы рестрикции MnlI. Известно, что при рестрикции дикого аллеля образуются продукты длиной 67, 37 и 163 п.о., в то время как при рестрикции мутантного аллеля размеры получаемых фрагментов составляют 67 и 200 п.о. Анализ полученных фрагментов проводили с помощью агарозного гель-электрофореза (рис. 2).

Рис. 1 – Электрофореграмма амплифицированного сегмента (содержащего нуклеотид № 1691) гена, кодирующего фактор Лейдена.

M - фрагменты ДНК c известным количеством пар оснований;

K+ - амплификация участка гена с использованием 10 нг очищенной ДНК;

1–20% - концентрация цельной крови в образце.

Рис. 2 – Электрофореграмма продуктов рестрикции сегмента (содержащего нуклеотид № 1691) гена, кодирующего фактор Лейдена.

M - фрагменты ДНК c известным количеством пар оснований; 1 – нативный сегмент; 2–3 - фрагменты полученные в результате обработки сегмента рестриктазой MnlI.

Из электрофореграммы на рис. 2 видно, что в обоих образцах содержатся фрагменты ДНК длиной 37, 67 и 163 п.о., что соответствует дикому аллелю. Следовательно, данные пациенты гомозиготны по дикому аллелю, т.е. не несут мутацию фактора Лейдена.

Таким образом, показано, что полученный нами химерный фермент (Sso7d-KlenTaq-ДНК-полимераза) выдерживает высокие концентрации цельной крови (до 20%) и может быть использован в качестве одного из компонентов аналитических тест-систем в клинико-лабораторных исследованиях.

Литература:

1. Kermekchiev M.B., Kirilova L.I., Vail E.E., Barnes W.M. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples // Nucleic Acids Res. 2009. – Vol. 37, № 5. – e40.

2. Pavlov A.R., Belova G.I., Kozyavkin S.A., Slesarev A.I. Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases / A.R. Pavlov [et al] // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2002. – Vol. 99. – P. 13510–13515.

3. Wang Y., Prosen D.E., Mei L., Sullivan J.C., Finney M., Vander Horn P.B. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro //Nucleic Acids Res. – 2004. – Vol. 32, № 3. – P. 1197–1207.

4. Sun S., Geng L., Shamoo Y. Structure and enzymatic properties of a chimeric bacteriophage RB69 DNA polymerase and single-stranded DNA binding protein with increased processivity // Proteins. – 2006. – Vol. 65, № 1. – P. 231–238.

5. Wu G., Wolf J.B., Ibrahim A.F., Vadasz S., Gunasinghe M., Freeland S.J. Simplified gene synthesis: a one-step approach to PCR-based gene construction // J. Biotechnol. 2006. Vol. 124, № 3. Р. 496–503.

6. Bertina R.M., Koeleman B.P., Koster T., Rosendaal F.R., Dirven R.J., de Ronde H., van der Velden P.A., Reitsma P.H. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C // Nature. – 1994. – Vol. 369, № 6475. – P. 64–77.