Петкевич М.В.*, Рымко А.Н.*, Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

*Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск

Получение магнитных наночастиц, пригодных

для сорбции ДНК

Применение наноматериалов в медицине и фармакологии является приоритетным направлением, позволяющим решать самые актуальные проблемы в данных областях знаний [1–3].

Наночастицы обладают высокоразвитой активной поверхностью и, как следствие, высокой сорбционной емкостью. Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации их под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы, сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз.

Магнитные наночастицы нашли широкое применение в диагностике in vitro. Разработан высокочувствительный метод цитометрического анализа образцов цельной крови, в основе которого лежит маркировка клеток крови ферромагнитными наночастицами. Магнитные наночастицы, сопряженные с антителами, используются для обнаружения опухолевых клеток в периферической крови, что позволяет оценивать эффективность химиотерапии, а также выделять клетки методом магнитной сепарации.

Очевидны перспективы использования магнитных наночастиц in vivo для диагностики и терапии. В настоящее время наночастицы, покрытые кремнием, для MRI-обнаружения опухолей различной локализации являются коммерческими продуктами. Свойство индуктивного нагревания наночастиц позволило разрабатывать идею их использования для гипертермического разрушения опухолевых клеток. Широко разрабатываются подходы к генотерапии онкологических заболеваний. В настоящее время проведены эксперименты по трансфекции генов с использованием суперпарамагнитных частиц на клетках эпителия легкого человека. Доставка специфических ДНК, РНК, олигонуклеотидов в определенные клетки может подавлять экспрессию гена либо инициировать синтез важных белков.

Таким образом, сегодня открываются перспективы для проведения высокочувствительной диагностики и высокоспецифичной и эффективной терапии различных заболеваний с помощью магнитных наночастиц. Постоянно синтезируется большое число новых наноматериалов и предлагаются новые подходы в области их биомедицинского применения.

В настоящее время существует огромное количество способов синтеза магнитных наночастиц. Одни из них – одностадийные, другие – многостадийные процессы. Все они имеют свои плюсы и минусы, но ни один из них не является универсальным для синтеза всех типов магнитных наночастиц.

Цель настоящего исследования – получение силанизированных магнитных наночастиц и проверка возможности их использования в качестве сорбента ДНК.

Материалы и методы исследования. Для получения магнитных наночастиц к 20 мл 1 М раствора NH₄OH добавляли 20 мл раствора, содержащего 0,1 М FeSO₄ и 0,1 M FeCl₃. Процедуру смешивания проводили в вытяжном шкафу, покапельно, с постоянным перемешиванием реакционной смеси. Полученную суспензию прогревали при 120°С в течении 15 мин. После остывания суспензии полученный магнетит (Fe₃O₄) дважды промывали 96% этанолом.

Для силанизации наночастиц к магнетиту при постоянном перемешивании в строгой последовательности добавляли 16,7 мл 96% этанола (до конечной концентрации 80%), 2,7 мл дистиллированной воды, 0,2 мл NH₄ОН и 0,4 мл тетраэтоксисилана. Полученную суспензию силанизированных наночастиц трижды промывали этанолом, помещали в водную среду и оставляли на «старение» на 3 сут. Для проверки качества силанизации наночастиц к 100 мкл суспензии магнетита добавляли 100 мкл 2 М НСl и после 2 ч проведения реакции замеряли оптическую плотность супернатанта при λ=295 нм.

Просвечивающую электронную микроскопию осуществляли, используя микроскоп JEM-100CX при ускоряющем напряжении 80 кВ. Образцы наносили на сетчатые никелевые мишени с нитроцеллюлозной подложкой и высушивали на воздухе в течение ночи.

Сорбцию ДНК на магнитные наночастицы проводили следующим образом. В пробирку на 1,5 мл вносили 50 мкл раствора геномной ДНК Escherichia сoli с концентрацией 5 мкг/мкл, 500 мкл 6 М NaClO₄ в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (pH 5,2), 100 мкл изопропанола и 50 мкл 50% суспензии магнетита. После тщательного перемешивания пробирку помещали на магнитный штатив и с помощью пипетки отбирали супернатант. К осадку добавляли 1 мл 80% этанола в 10 мМ трис-НСl (pH 8,0), перемешивали и снова отбирали супернатант. К осадку добавляли 1 мл 5% этанола, отбирали супернатант и приливали 100 мкл 10 мМ трис-НСl (pH 8,8). Полученную смесь помещали на водяную баню (70°С) на 5–10 мин, после чего отбирали супернатант для измерения в нем количества ДНК. Для количественного определения ДНК к 10 мкл супернатанта прибавляли 190 мкл 6-тикратного интеркалирующего красителя Sybre green (Sigma, США) в 10 мМ трис-НСl (pH 8,0), после чего замеряли величину флуоресценции.

Для определения возможности использования ДНК, десорбированной с магнитных наночастиц, в генно-инженерных исследованиях образец такой ДНК вносили в реакционную смесь следующего состава: 67 мМ трис-HCl (pH 8,3), 17 мМ (NH₄)₂SO4, 2 мМ MgCl₂, 0,02% Твин-20, каждый из четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов в концентрации 0,02 мМ, 10 пмоль праймеров к последовательности гена уридинфосфорилазы E. coli и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы. В качестве положительной пробы использовали ДНК E. сoli, в качестве отрицательной пробы – воду. Амплификация выполнялась по программе: 2 мин 94ºС, (30 сек 94ºС; 15 сек 55ºС; 2 мин 30 сек 72ºС) – 25 циклов; 2 мин 72ºС. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле.

Результаты исследования. Синтез магнитных наночастиц, осуществленный по представленной выше методике позволил получить 20 мг магнитных наночастиц.

Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому для практического использования растворов магнитных наночастиц необходима их стабилизация. После покрытия наночастиц SiO₂ их масса увеличилась до 25 мг. УФ-спектрофотометрические исследования показали, что магнитные наночастицы полностью силанизированы и устойчивы к действию соляной кислоты.

На полученных микрофотографиях магнитные наночастицы имели вид крупных агрегатов, состоящих из частиц меньшего размера. Маленькие частицы выглядели довольно гомогенными и имели округлую форму. Размер их колебался от 15 до 25 нм с диаметром ядра 15–20 нм и силановым слоем около 5 нм.

В результате проведенных экспериментов было показано, что полученные нами магнитные наночастицы с сорбированной ДНК способны высвобождать до 65% исходной ДНК. Исходя из результатов измерений, в процессе сорбции с 1 мг полученного сорбента десорбировалось 32,4 мкг ДНК.

Проведенная полимеразная цепная реакция показала, что десорбированная с магнитных наночастиц ДНК является хорошим объектом для дальнейших генно-инженерных исследований. Анализ ДНК проводили с помощью агарозного гель-электрофореза. На электрофореграмме (рисунок 1) видно, что опытные образцы содержат около 700 п.о. и соответствуют контрольному.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов получены покрытые оксидом кремния магнитные наночастицы, обладающие хорошей ДНК-сорбционной способностью. Выход сэлюированной ДНК составил 32,4 мкг нуклеиновой кислоты на 1 мг магнитных наночастиц, а эффективность выделения ДНК составляет 65% от исходного количества. Показано, что выделенная с помощью магнетита ДНК пригодна для постановки ПЦР.

Рисунок 2 – Электрофореграмма продуктов амплификации гена уридинфосфорилазы E. coli

1–2 – ДНК, элюированная с магнитных наночастиц; 3 – исходная ДНК; 4 - отрицательный контроль; 5 - фрагменты ДНК с известным числом оснований

Разработанный способ получения магнитных наночастиц не требуют использования энергоемкой и сложной вакуумной и высокотемпературной техники, он экологически безопасен и относительно прост, что делает его перспективным для практического использования.

Литература:

Riehemann K., Schneider S.W., Luger T.A., Godin B., Ferrari M., Fuchs H. Nanomedicine – challenge and perspectives // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2009. Vol. 48, N 5. P. 872–897.

Sakamoto J.H., van de Ven A.L., Godin B. et. al. Enabling individualized therapy through nanotechnology // Pharmacol. Res. 2010. Vol. 62, N 2. P. 57–89.

Sniadecki N.J. Minireview: a tiny touch: activation of cell signaling pathways with magnetic nanoparticles // Endocrinol. 2010. Vol. 151, N 2. P. 451–457.