зучение влияние ионов тяжелых металлов на уровень перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантной защиты

Экология/1.Состояние биосферы и его влияние на здоровье человека.

PhD докторант Дарибай А.О

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева

Изучение влияние ионов тяжелых металлов на уровень перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантной защиты

Экологическая обстановка промышленных городов характеризуется интенсивным загрязнением окружающей среды химическими веществами. Одним из приоритетных загрязнителей являются тяжелые металлы (Cu, Pb, Fe, Cr и др.), накопление которых в организме оказывает токсический эффект, создавая метаболическую и структурную основу для снижения резистентности организма с последующим развитием различных заболеваний и их хронизацией.

Все живые организмы разными способами реагируют на изменения окружающей среды. Формирование защитных эффектов адаптации обеспечивается активацией генетического аппарата, изменением метаболизма клетки, а также изменением функционирования практически всех основных систем организма. Любые сильные воздействия окружающей среды вызывают стандартную стресс-реакцию. При кратковременном действии стрессов умеренной интенсивности происходит усиление функционирования органов и мобилизация организма. Однако, при интенсивной или длительной стресс-реакции в клетках происходит активация процесса свободно-радикального окисления, внутриклеточная кальциевая перегрузка, угнетение энергопродукции, снижение синтеза белка и денатурация белковых структур. Это оказывает повреждающее воздействие на органы, ткани, и, таким образом стресс-реакция из звена адаптации превратится в звено патогенеза. Однако, активации стресс-систем и реализации повреждающих эффектов препятствуют стресс-лимитирующие системы. Одним из возможных компонентов быстрой реакции на стресс является активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1-3].

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), играя важную роль в нормальном функционировании клетки, выступают и как ранние ключевые звенья ответной реакции организма на стрессорные состояния. Интенсивная физическая нагрузка, являясь стрессовым фактором, также сопровождается активацией процессов ПОЛ. Кроме того, при любой физической нагрузке потребление кислорода в органах возрастает в несколько раз и зависит от интенсивности и длительности нагрузки. Соответственно повышается уровень свободнорадикальных процессов в тканях. Усиленное образование продуктов ПОЛ в организме при мышечной нагрузке может свидетельствовать о снижении активности антиоксидантной системы (АОС) [4-6]. Соотношение этих процессов в организме во многом определяет структуру и функции биологических мембран. Поскольку гидроперекиси - первичные продукты ПОЛ и играют центральную роль в аутоокислении липидов, изучение влияния промышленных загрязнителей или образование антиоксидантов при образовании гидроперекисей может рассматриваться как важнейший метод оценки оксидантной или антиоксидантной активности оксиданта или антиоксиданта соответственно [7-10].

Основной целью данной работы являлась оценка уровня перекисного окисления и уровня антиоксидантной защиты организма при воздействии ионов тяжелых металлов.

Материалы и методы. Тиобарбитуровая кислота (Реахим, РФ), тритон Х-100 Merck, Германия), трилон Б (Реахим, РФ), этанол (Ромат, РК), 0,08% пероксид водорода; 4,5%-й раствор аммония молибденовокислого, CuSO₄, CuCl, CrO₃, FeSO₄, ZnSO₄, Pb(NO₃)₂.

Определение ПОЛ. 0,5 мл супернатанта последовательно добавляют 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК (раствор тиобарбитуровой кислоты готовят растворением 864 мг ТБК в 100 мл 1% раствора тритона Х-100 с 50% ным этанолом). Пробирку со смесью нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение пробирки проводят при температуре 15 в течение 30 мин. Для стабилизации окраски после охлаждения добавляют 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и 5-10 мл 96% этанола. Контролем служит пробирка в которую добавляют все эти растворы кроме ТБК. За накоплением продукта ПОЛ – молонового диальдегида следили по реакции с ТБК при 532 нм,е = 155 мМ^-1 см [11].

Определение каталазной активности.

Активность каталазы изучали методом основанном на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс. Активность исследуемого фермента определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм.

Определение белков в сыворотке крови, рН мочи проводили с помощью тест –систем penta PHAN (Рliva Lachema Diagnostika , Чехия).

Результаты и обсуждение. В экспериментах использовались 2-х месячные мыши–самцы (SHK), содержавшиеся на стандартной диете, массой 20 грамм. Мыши были подвергнуты однократному воздействию в острой дозе ионов цинка, хрома, железа, меди, свинца. Для острой затравки внутрибрюшинно было введено 0,5 мг вещества на животное.

Была проведена оценка ПОЛ через определение содержания малонового диальдегида (МДА) с последующим спектрофотометрическим определением конечного продукта окисления. Субстратом для данной реакции являлся малоновый диальдегид и другие низкомолекулярные диальдегиды, который образовывались в результате разрушения эндопероксидов полиненасыщенных жирных кислот. Сущность реакции заключается в том, что МДА реагирует с 2'-тиобарбитуровой кислотой (ТБК), с образованием розового продукта с максимумом поглощения при 532 нм и рН менее 3.

Для последующей количественной оценки образовавшихся диальдегидов мы применили спектрофотометрический метод, основанный на определении оптической плотности образовавшегося хромогенного комплекса с 2'-тиобарбитуровой кислотой (l= 532 нм, е=155мМ^-1см^-1) по методу описанному в работе [11]. В таблице 1. Влияния ионов тяжелых металлов на уровень содержания продуктов ПОЛ (МДА) в сыворотке и уровень белка в моче 2 месячных мышей при острой затравке (табл. 1) и хронической затравке (табл.2) ионами тяжелых металлов (CuSO₄, CuCl, CrO₃, FeSO₄, ZnSO₄, Pb(NO₃)₂).

Из таб.1 видно, что острая затравка мыши CuSO₄, CrO₃, FeSO₄, ZnSO₄, Pb(NO₃)₂ в ~1,5-2 раза привело к увеличению уровеня МДА в сыворотке крови по сравнению с контролем. Влияние CuCl и Pb(NO₃)₂ на уровень ПОЛ практически не оказала существенного влияния. Повышение содержания МДА в сыворотке крови интоксикации ионами тяжелых металлов обусловлено нарушением увеличением интенсивности окислительно-восстановительных процессов протекающих в организме.

Таблица 1 Уровень ПОЛ (по МДА) в сыворотке и уровень белка в моче при острой интокцикации ионами тяжелых металлов

№	Наименование токсиканта	МДА, мМ	Белок, г/л	рН
1.	Контроль	0,265±0,012	3±0,12	5
2.	CuSO4	0,49±0,026	92±2,1	5,5
3.	CuCl	0,29±0,075	27±0,9	6
4.	CrO3	0,34±0,040	30±1,3	6
5.	FeSO4	0,34±0,02	395±12,2	6
6.	ZnSO4	0,333±0,071	82±5,8	6,5
7.	Pb(NO3)2	0,29±0,01	30±1,5	5,5

В случае хронической затравки значительное усиление процессов ПОЛ было вызвано CuSO₄, CrO₃, FeSO₄. Уровень МДА был выше в ~1,5-2 раза как и в случае острой затравки. Влияние ионов цинка, свинца и одновалентной меди при хронической интоксикации было незначительным и составило ~1,1 раза в сравнении с контролем.

Таблица 2 Уровень ПОЛ (по МДА) в сыворотке и уровень белка в моче при хронической интокцикации ионами тяжелых металлов

№	Наименование токсиканта	МДА, мМ	Белок, г/л	рН
1	Контроль	0,265±0,012	3±0,12	5
2	CuSO₄	0,52±0,024	78±0,12	6
3	CuCl	0,3±0,06	22±0,12	6,3
4	CrO₃	0,41±0,05	42±0,12	6,5
5	FeSO₄	0,41±0,03	182±9,8	6
6	ZnSO₄	0,29±0,06	65±0,12	6
7	Pb(NO₃)₂	0,31±0,02	73±0,12	6

Обнаружены различия влияния одновалентной и двухвалентной меди. При интоксикации ионами двухвалентной меди уровень содержания МДА в сыворотке в 1,7 раза выше, чем при интоксикации ионами двухвалентной меди. Такое различие, скорее всего, связано с тем, что ионы меди имеют переменную валентность и соответственно напрямую вовлечены в процессы ПОЛ. Однако влияние CuCl обуславливается наличием ионов хлора, которые образуют прочное соединение с ионами меди и процесс окисления этого вещества протекает менее интенсивно, что и наблюдалось при его оценке на уровень ПОЛ в сравнении с CuSO₄.

Анализ изменения рН мочи после воздействия ионов тяжелых металлов показало существенное изменение этого показателя. Наблюдалось увеличение содержание общего белка в моче исследуемых животных.

Дополнительно было проведено изучение влияние острых и хронических доз сульфата цинка и сульфата меди на систему антиоксидантной защиты (АОЗ). Влияние тяжелых металлов при остром и хроническом воздействии определяли по уровню каталазной активности (КА) в сыворотке крови (табл.).

№	Наименование токсиканта	Активность каталазы при хронической затравке, мкмоль H₂O₂/мл/мин сыворот.	Активность каталазы при острой затравке, H₂O₂/мл/мин сыворот.
1	Контроль	0,6±0,06	0,6±0,06
2	CuSO₄	0,31±0,04	0,36±0,03
3	CuCl	0,58±0,06	0,59±0,03
4	CrO₃	0,68±0,03	0,62±0,02
5	FeSO₄	0,16±0,07	0,22±0,04
6	ZnSO₄	0,71±0,06	0,63 ±0,025
7	Pb(NO₃)₂	0,6±0,03	0,6±0,02

Уровень каталазной активности при острой и хронической интоксикации CuSO₄ и FeSO₄ был значительно ниже, в ~2 и ~4раза соответственно. Анализ каталазной активности в сыворотке крови при воздействии ионов цинка показал небольшое увеличение антиоксидантной активности при хронической затравке ионами цинка. Образующаяся стабильная недостаточность антиоксидантной системы, происходит на фоне увеличения содержания МДА и подавлением активности каталазы в сыворотке крови при воздействии CuSO₄ и FeSO₄. Полученные данные каталазной активности при воздействии CuCl, CrO₃, Pb(NO₃)₂ в целом сопоставимы с контролем.

Таким образом, изменение уровня ПОЛ мышей подвергнутых воздействию ионов тяжелых металлов коррелируют с изменениями рН и содержание общего белка в моче и уровнем каталазной активности организма исследуемых животных.

Список литературы

1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Шергин С.М. Биохимия окислительного стресса. Оксиданты и антиоксиданты. // 1994. Новосибирск. 203 с.

2. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активированные формы кислорода и их роль в организме // Успехи биол. Химии. 1990. Т. 31. С. 180-208.

3. Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. // Москва.: “Высшая школа.’’ 1988. 424 с.

4. Ames B.N. Endogenous DNA damage as related to cancer and aging. // Mutat. res. 1989. Vol. 214. P. 41-46.

5. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen T.M. Oxidants, antioxidants and degenerative diseasesof aging. // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 7915-7922.

6. Anson R.M., Hudson E., and Bohr V.A. Mitochondrial endogenous oxidative damage has been overestimated. // FASEB J. 2000. Vol. 14. P. 355-360.

7. Beckman K.B. and Ames B.N. Endogenous oxidative damage of mtDNA. // Mutat. Res. 1999. Vol. 424. P. 51-58.

8. Hamilton M.L., Van Remmen H., Drake J.A., Guo Zh.M., Yang H., Kewitt K., Walter C.A. and Richardson A. Does oxidative damage to DNA increase with age? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 28. P. 10469-10474b.

9. Skulachev V.P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms. // Mol. Aspects Medicine. 1999. Vol. 20. P. 139-184.

10. Sohal R.S. Aging, cytochrome oxidase activity, and hydrogen peroxide release by mitochondria. // Free Radic. Biol. Med. 1993. Vol. 14(6). P. 583-588.

11. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.:Наука, 1972, 252с