Биологические науки/Микробиология

к.б.н. Лахтин М.В., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.б.н. Алешкин В.А., д.м.н. Афанасьев С.С.

Отдел медицинской биотехнологии, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

Биопленки грамположительных бактерий c нарушенными сборкой и метаболизмом в присутствии лектинов лактобацилл и бифидобактерий: прогнозируемая деградация биопленок.

Резюме

Биосовместимые и биодеградируемые биопленки грамположительных бактерий неправильно организовывались в присутствии лектинов пробиотических бактерий. Результирующие биопленки проявляли варьирующие фенотипы (эластичность, ригидность, толщина, характер границ, время созревания, контакт с субстратом, инфраструктура каналов, деградация). Неправильная сборка позволяла прогнозировать характер дальнейшей деградации и лизиса биопленок в соответствии с измененным алгоритмом инволюции биопленки. Ключевые слова: биопленка, грамположительные бактерии, лектины пробиотиков, сборка и деградация.

Resume

Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A., Afanasiev S.S.

Department of Medical Biotechnology, G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia

Gram-positive bacterial biofilms with both wrong assembling and metabolism states in the presence of lactobacillus and bifidobacterial lectins: predicted biofilm degradation.

Biocompatible and biodegradable microbial biofilms are able to wrong organization in the presence of probiotic bacterial lectins. Resulting biofilms revealed varied phenotypes (elasticity, rigidness, thickness, character of borders, time of maturation, contact to substrate, infrastructure of channels, degradation). Wrong assemblies allowed prediction of the character of further degradation and lysis of biofilms according to changed involution algorithm. Key words: biofilm, Gram-positive bacteria, probiotic lectins, assembly, degradation.

Введение: Лектины относятся к системным распознающим гликоконъюгаты белкам и пептидам [1]. Нами из индустриальных штаммов бифидобактерий и лактобацилл были получены синергидные препараты пробиотических лектинов (ПЛ), стандартизированные по физико-химическим, биохимическим и биологическим свойствам [2]. Синтезируясь в организме человека, ПЛ проявляют спектр полезных для организма свойств в субцитоагглютинирующих и близких к физиологическим концентрациях. Они имитируют пробиотическую микрофлору в организме и, являясь метаболомбиотиками, противодействуют потенциальным возбудителям инфекций [3].

Механизмы фенотипического разнообразия биопленок грамположительных бактерий и их связь с метаболическим состоянием остаются мало изученными [4]. Отмечена регуляция окружающей жидкостью фенотипов Staphylococcus aureus и участие в регуляции белков слоев пленок стафилококков [4, 5].

Учитывая вышесказанное, можно ожидать, что ПЛ, подобно пробиотикам, регулируют сборку и разборку биопленок in vivo и in vitro. Цель – исследовать потенциал лектинов лактобацилл и бифидобактерий для конструирования фенотипов биопленок, способных к прогнозируемым деградации и лизису.

Материалы и методы: Использовали препараты лектинов лактобацилл и бифидобактерий (ЛЛ и ЛБ), полученные, как описано ранее [2]. Штаммы бактерий - из коллекции микроорганизмов института эпидемиологии и микробилогии им. Г.Н. Габричевского. Формирование и рост бактериальных пленок на агаре проводили в присутствии капельно внесенных препаратов лектинов в цитоагглютинирующих концентрациях при 37^оС в течение суток и затем при пониженной температуре в течение 2-3 месяцев. Оценку пленок проводили визуально и по цифровым фотографиям.

Результаты: Фенотипы биопленок стафилококков зависели от типа присутствующих лектинов. Модельные биопленки стафилококков неправильно организовывались в присутствии ПЛ, а результирующие биопленки проявляли фенотипы, варьирующие по таким признакам, как эластичность, ригидность, толщина, характер границ, время созревания, прочность и форма контакта с субстратом, инфраструктура каналов, характер последующей деградации. Некоторые признаки биопленок были сцепленными (эластичность, истонченность и прозрачность; ригидность, утолщенность, бугристость и прочность контакта с субстратом; утолщенность, многослойность и выраженность сети каналов). Присутствие ЛЛ изменяло фенотип биопленки стафилококков в сторону повышения ее эластичности, однородности и прозрачности. В то же время присутствие ЛБ изменяло фенотип биопленки стафилококков в сторону повышения ее ригидности, бугристости, выраженности сети каналов и прямолинейных ломанных границ.

Неправильная сборка биопленки стафилококков в присутствии ПЛ позволяла прогнозировать характер ее дальнейшей деградации и лизиса в соответствии с измененным алгоритмом инволюции биопленки. В присутствии ЛЛ наблюдались истончение биопленки и ее лизис в местах истончения, а в присутствии ЛБ наблюдались фрагментация биопленки в соответствии с сетью каналов, ослабление связи с субстратом и дальнейший лизис фрагментов.

Обсуждение результатов: В работе установлены новые фенотипы биопленок стафилококков и способы их получения с использованием ЛЛ и ЛБ. По сравнению с полистироловым субстратом полисахаридная (агаровая) поверхность имеет очевидное преимущество - возможность получения «нативных» (не поврежденных) биопленок, благодаря их более легкому снятию. С учетом более или менее выраженного вклада в биопленку экзополимерных компонентов (в том числе полисахаридных), по-видимому, утолщенная, ригидная и бугристая биопленка с ограненными (ломанными) границами может рассматриваться как полисахарид-зависимая. Поскольку формирование полисахарид-независимых фенотипов стафилококков обусловлено специальными генами и предполагает участие внеклеточных протеиназ и автолиза [6], можно предположить влияние ПЛ как на экспрессию соответствующих генов, так и на метаболический статус биопленки стафилококков. Еще одним путем влияния ПЛ на сборку и разборку биопленок стафилококков могла бы быть конкуренция между ПЛ и ключевыми белками сборки (белок-А и белок-А-подобными поверхностноклеточными), а также между ПЛ и олигопептидами чувства кворума стафилококков, важными для правильной сборки биопленки [4, 7]. Неоднозначное влияние ПЛ на процесс эволюции и инволюции биопленки грамположительных бактерий, очевидно, связано с мультифункциональным и каскадным действиями ПЛ вне- и внутри матрикса пленки. Кроме того, ПЛ следует рассматривать и в качестве потенциальных модуляторов ферментов, особенно гидролаз [8, 9].

Результаты настоящей работы указывают на то, что ПЛ в модельных условиях способны влиять на процессы сборки биопленок грамположительных бактерий на разных этапах развития, что приводит к сборке по «неправильным» алгоритмам. Это, в свою очередь, нарушает и метаболические состояния биопленок, что, в конечном счете, приводит к дальнейшим их дезорганизации и лизису в соответствии с алгоритмом, обратным алгоритму сборки. Полученные данные являются дополнительным подтверждением того, что ПЛ участвуют в сигнальных коммуникациях и могут быть использованы вместо пробиотических клеток в составе биопленок в качестве регуляторов и для «переобучения» микробиоценоза в заданном полезном направлении.

С точки зрения лечебного аспекта, направленное извне изменение метаболизма биопленок может способствовать формированию новых мишеней для лекарств, а значит, и новых перспектив борьбы с биопленками [10], в том числе с использованием ПЛ. Рассматривается возможность регуляции продукции вирулентных факторов в биопленках (потенциально и с помощью ПЛ –смотри выше) как важный аспект инактивации сформировавшихся патогенных биопленок [11]. Проблема безопасного функционирования грамположительных биопленок может быть решена и путем прямой инактивации метаболической активности биопленок высокомолекулярными природными ксенокомпонентами [12]. ПЛ, в свою очередь, не только способны формировать узнающие биосовместимые надмолекулярные комплексы, но и ограничивать (локализовывать) метаболизм модельных клеточных биопленок на внутриклеточном уровне защищенных от цитолиза эритроцитов человека на фоне снижения массы и выраженности биопленки [13, 14].

Из числа других важных перспектив ПЛ следует отметить необходимость учета фенотипа биопленки при конструировани вакцин [15]. В этом случае ПЛ могли бы служить еще одним инструментом для мониторинга фенотипов биопленок. В целом, феноменология биопленок вписывается в перспективное научное направление – изучение архитектуры микроценозов [16]. Поскольку действие ЛЛ и ЛБ синергидно и каскадно в пространстве и по времени, перспективно, по-видимому, комбинированное применение ПЛ для получения расширенного набора предсказуемых фенотипов биопленок.

Заключение: Результаты демонстрируют новый потенциал ПЛ, имеющий как промышленное значение (разработка новых направленных и регулируемых биоматериалов на основе растущих биопленок), так и медицинское значение (возможность направленным образом модулировать рост, фенотип, метаболические состояния и деградацию биопленок, проблемных для медицины). Результаты также указывают на перспективы алгоритмического подхода (сборка - разборка) для конструирования биосовместимых и биодеградируемых 3D-микро- и нанобиоматериалов с использованием имитирующих клетки микро- и нанотехнологий.

Литература:

1. Lakhtin M., Lakhtin V., Alyoshkin V., Afanasyev S. Lectins of beneficial microbes: system organization, functioning and functional superfamily // Beneficial Microbes. - 2011. – V. 2; No 2. – P. 155 – 165.

2. Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Pospelova V.V., Shenderov B.A. Lactobacilli and bifidobacteria lectins as possible signal molecules regulating intra- and interpopulation bacteria-bacteria and host-bacteria relationships. Part I. Methods of bacterial lectin isolation, physicochemical characterization and some biological activity investigation // Microb. Ecol. Health. Dis. - 2006. - V. 18. - P. 55 - 60.

3. Lakhtin M., Lakhtin V., Bajrakova A., Aleshkin A., Аfanasiev S., Aleshkin V. Interaction of Probiotic Bacterial Lectins to Candida species // Сборник материалов конференции «Наука и технологии: шаг в будущее» (27 февраля - 5 марта, 2012, Прага, Чехия).

4. Archer N.K., Mazaitis M.J., Costerton J.W., Leid J.G., Powers M.E., Shirtliff M.E. Staphylococcus aureus biofilms: Properties, regulation and roles in human disease // Virulence. – 2011. – V. 2. – P. 445 - 459.

5. Castro S.L., Nelman-Gonzalez M., Nickerson C.A., Ott C.M. Induction of attachment-independent biofilm formation and repression of hfq expression by low-fluid-shear culture of S. aureus // Appl. & Environm. Microbiol. – 2011. V. 77. – P. 6368 – 6378.

6. Boles B.R., Thoendel M., Roth A.J., Horswill A.R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent S. aureus biofilm formation // PLoS ONE. – 2010. – V. 5; No 4: e10146. doi:10.1371/journal.pone.0010146.

7. Thoendel M., Kavanaugh J.S., Flack C.E., Horswill A.R. Peptide signaling in the staphylococci // Chem. Rev. – 2011. – V. 111. – P. 117–151. DOI:10.1021/cr100370n.

8. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Алешкин А.В. Лектины и ферменты в биологии и медицине. М.: Изд.«Династия», 2010. 496 с.

9. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Alyoshkin V.A. Lectin and enzyme relationships in microbiology // Int. J. Mol. Clin. Microbiol. - 2011. – V. 1; No 1. – P. 9 - 14.

10. Fey P.D. Modality of bacterial growth presents unique targets: how do we treat biofilm-mediated infections? // Curr. Opin. Microbiol. – 2010. – V. 13. P. 610 – 615.

11. Sanchez C.J., Kumar N., Lizcano A., Shivshankar P., Hotopp J.C.D., Jorgensen J.H., Tettelin H., Orihuela C.J. Streptococcus pneumoniae in biofilms are unable to cause invasive disease due to altered virulence determinant production // PLoS One. – 2011. V. 6; No12: e28738. DOI: 10.1371/journal.pone.0028738.

12. Jegdish B., Cohen B., Shiloah J., Ofek I. Inhibition of Streptococcus gordonii metabolic activity in biofilm by cranberry juice high-molecular-weight component // J. Biomed. & Biotechnol. – 2012, Article ID 590384. DOI:10.1155/2012/590384.

13. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Корсун В.Ф., Шендеров Б.А. Совместный потенциал лектинов пробиотических микроорганизмов и грибов в условиях организации и функционирования модельных эукариотических клеточных биопленок - для дальнейшего использования в клинической практике в составе фитокомпозиций // Практическая фитотерапия. - 2008. - № 2. - С. 11 - 17.

14. Лахтин М.В., Алешкин В.А., Лахтин В.М., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Роль лектинов пробиотических микроорганизмов в жизнеобеспечении макроорганизма // Вестник РАМН. - 2010. - № 2. - С. 3 - 8.

15. Harro J.M., Peters B.M., O’May G.A., Archer N., Kerns P., Prabhakara R., Shirtliff M.E. Vaccine development in S. aureus: taking the biofilm phenotype into consideration // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2010. – V. 59. – P. 306 – 323.

16. Кордюм В.А., Шпилевая С.П., Мошинец Е.В., Адамчук-Чалая Н.И., Иродов Д.И., Андриенко В.И. Биополимеры и клетки в измерении архитектуры микроценозов. 1. Феноменология // Биополимеры и клетки (Киев). – 2009. – Т. 25. – С. 150 – 166.