Д. с.-х. н. Кикебаев Н.А., к.с.-х. н. Сафронова О.С.
Костанайский конный завод, ТОО «Қазақ
тұлпары», Казахстан
Криоконсервация семени жеребцов
костанайской породы с применением различных защитных сред
Успешная криоконсервация семени жеребцов зависит от сложной взаимосвязи
разбавителя и криозащитных веществ,
скорости охлаждения и оттаивания спермы для уменьшения повреждения от
холодового шока и образования кристаллов льда и др. Но если основные параметры
технологического процесса достаточно ясно определены – они, в основном, зависят
от объема спермодозы при замораживании, то эксперименты со средами для
центрифугирования и криозащиты ведутся постоянно.
Целью наших исследований в 2010-2012 гг. являлось
замораживание семени жеребцов костанайской породы с использованием нескольких сред
для центрифугирования и криоконсервации –INRA 96 (флюид Maxifeeze),
INRA-FREEZE; Кенея, В-4
(Бернса); Тулпар-2/1, Тулпар-2/2 (модифицированная М-1) по соответствующим методикам [1,2,3].
Для процессов были использованы эякуляты 7
жеребцов костанайской породы 7-14 лет. Характеристика среднего нативного
семени: М(масса) =35,61+7,92 г. σ=20,95, Cv=58,83; А (активность)
=4,86+0,26 б., σ=0,69, Cv=14,21; К (концентрация) =258,86+55,57
млн/мл., σ=147,02, Cv =56,79. После размораживания образцы показали
следующую активность (в баллах): Т-2 А=3,66+0,37, σ =0,98,
Cv=26,76; INRA А=2,71+0,46, σ
=1,21, Cv=46,26; В-4 А=3,29+0,15., σ=0,39, Cv=11,96. Разница
показателей не достоверна, основанная причина – значительная разница
индивидуальных параметров жеребцов. Корреляционная связь между показателем
активности нативного и заморожено-оттаянного семени составила по Т-2 0,035
(малая), В-4 0,428 и INRA 0,463 (средняя,
положительная).
Для лабораторных испытаний активности,
переживаемости и определения оплодотворяющей способности опытного
криоконсервированного семени взяты эякуляты двух жеребцов-производителей одного
возраста со схожими характеристиками нативного семени, в том числе
морфологическими, и криоустойчивости. Результаты изложены в рисунке 1. Для
наглядности и упрощения анализа, полученные данные были приведены к единому
расчетному показателю, например: активность нативного семени обоих жеребцов (7
баллов – 70% живых поступательно подвижных спермиев) взята за расчетный
показатель – как 100%.
Рисунок 1 - Снижение активности
заморожено-оттаянного семени в сравнении с нативными эякулятами (в %).
Исходя из представленных данных наилучшие
показатели активности размороженного семени показала среда INRA96/ INRA-FREEZE -
качество семени снизилось в среднем всего на 31,4% (у №1 ухудшение на 19,23%, а
у №2 – на 42,86%), второй показатель у Кенея/В-4 (Пэта Бернса для
замораживания) – на 35,96% (у №1 ухудшение на 33,29%, а у №2 – на 38,83%). Среда
Т-1/ Т-2 имеет самые низкие оценки – снижение в среднем на 45,63%. Несмотря на
лучшие средние показатели у INRA, два других варианта имеют серьезное
преимущество за счет равномерности результатов (индивидуальная фертильность
находится в пределах 4-5%, против 24% по первой).
Результаты выживаемости опытного размороженного
семени (V= 1 мл., дополнительное разбавление после
размораживания не проводилось, через указанные ниже промежутки времени часть
образца нагревалась до 38ºC и анализировалась), хранимого при
+5ºC, характеризует рисунок 2.
Начальная активность анализируемых эякулятов двух жеребцов по трем вариантам (INRA,B-4,T-2) после размораживания взята за расчетные 100 %,.
Рисунок 2 – Активность
заморожено-оттаянного семени в зависимости от времени хранения.
Анализ результатов проведенных
исследований выявил значительное превосходство по переживаемости семени,
криоконсервированного со средой В-4 у обоих жеребцов. Через сутки хранения,
активность снизилась всего в среднем на 10% (7,8 и 11,3% по жеребцам соответственно), через 48 ч. – на 20%, 72 ч.
– на 32%, 96 ч.- на 47%. Два других варианта замораживания при контроле 96
часов показали активность менее 1 балла и не представлены в диаграмме. В целом,
скорость снижения активности составила:
В-4 – 0,48% в час или 11,75% в сутки; Т-2 – 0,89% в час и 21,5% в сутки и INRA – 0,98% в час или 23,4% в сутки. Таким образом, результаты наших испытаний
заморожено-оттаянного семени, изложенные в статье, не выявили безусловного
лидера: по снижению активности после размораживания лучшие результаты имела
среда INRA 96/INRA-FREEZE, по переживаемости заморожено-оттаянного семени - Кенея/В-4 (Пэта Бернса), по влиянию
индивидуальной фертильности на активность после размораживания - Т-1/2.
Проведенное искусственное осеменение двенадцати
кобыл заморожено-оттаянным семенем показали равно высокую оплодотворяющую
способность криоконсервированного с тремя парами сред семени (на уровне 80%, при использовании: контроль УЗИ,
осеменение в вершину рога с прогнозируемой овуляцией, ветпрепараты по
показаниям: «Овулин» (hCG),
«Магэстрофан» (ПГF2a), «Утеротон»
(пропранолол гидрохлорид), «Гамавит» (ПДЭ), «Е-селен»).
Учитывая все виды и направления
проведенных работ, установлено, что дополнительные характеристики семени,
определяемые по результатам лабораторных исследований заморожено-оттаянных
образцов (выживаемость, активность после оттаивания и др.), при условии
получения продукции не ниже стандартных требований (количество активных с
поступательными движениями сперматозоидов > 30 %), являются
косвенными и не влияют на основной оценочный признак – оплодотворяемость.
Литература:
1. Fertility
of unfrozen and frozen stallion spermatozoa extended in EDTA-lactose-egg yolk
and packaged in straws/ P.R. Loomis, R.P. Amann, E.L. Squires, B.W. Pickett//
Journal Animal Science.-1983.-Vol.56. -№ 3.-P.687-693.
2. Cochram J. Effects of centrifugation,
glycerol level, cooling to 5°C, freezing rate and thawing rate on the post-thaw
motility of equine sperm// Theriogenology / R.P.Amann, D.P.Froman, B.W.Pickett.1984.-№ 22.- Р.25-39.
3. Робинсон Э. Болезни лошадей.
Современные методы исследования. –М.: Аквариум,2007.- С.310-312.