ВЭЖХ–метод определения алкалоидов Chelidonium majus L. и их тиофосфорных производных (использование для диагностики рака и изучения механизмов канцерогенеза)

Глазев А.А.

НИЛ биохимии биологически активных веществ ГрГУ им. Я.Купалы, г. Гродно

В настоящее время при поиске новых подходов для диагностики и терапии раковых патологий особое внимание уделяется естественным метаболитам, как веществам высокоэффективным и малотоксичным, обладающим широким спектром биологического действия.

Одним из перспективных направлений в современной клинической биохимии является использование модификаторов биологических реакций (BRMs), которыми являются алкалоиды чистотела большого (Chelidonium majus L.) и их производные.

Неоднократно независимыми методами показано специфическое взаимодействие алкалоидов и их производных с канцероцитами и их структурными компонентами, включая клеточные мембраны иммунокомпетентных клеток, что открывает перспективы для их применения в диагностике рака. Однако исследования в данном направлении сдерживаются отсутствием адекватных и высокоселективных аналитических методов детекции основных алкалоидов чистотела и их производных в биологическом материале.

Целью данной работы является разработка нового высокочувствительного и селективного метода идентификации основных алкалоидов чистотела и их производных в биологическом материале (плазме и форменных элементах крови человека).

С точки зрения выбора аналитического метода для определения концентраций основных алкалоидов чистотела наиболее адекватным и эффективным из используемых в настоящее время является метод ВЭЖХ.

При тестовом разделении алкалоидов чистотела использовали подвижную фазу следующего состава: элюент А: 0,1 М калий-фосфатный буфер pH 7,4 и элюент B — CH₃CN/H₂O = 3/2. При выборе состава подвижной фазы и подборе оптимального профиля изократического элюирования целью оптимизации было максимальное использование эффективности колонки и обнаружение за приемлемое время аналитического цикла максимального количества исследуемых соединений в пробе и идентификация их пиков. Поэтому профиль изократического элюирования соответствовал заданному поддерживаемому уровню элюента В равному 50% и 50% элюента А на всем протяжении времени анализа. Это позволило максимально уменьшить длительность анализа при сохранении достаточно высокой разрешающей способности. Скорость потока подвижной фазы выбиралась в пределах 0,4 — 0,5 мл/мин, Выбор был сделан в сторону скорости равной 0,4 мл/мин, что обеспечивало эффективность разделения, близкую максимально возможной.

Для повышения стабильности параметров разделения во времени и воспроизводимости подбиралась оптимальная температура разделения т.к. подбирая определенную температуру разделения, можно изменять селективность, вплоть до получения полного (до базовой линии) разделения прежде не разделявшихся пиков (тем самым повысив разрешающую способность), а также значительно повысить воспроизводимость параметров разделения и надежность идентификации пиков. В качестве оптимальной была выбрана температура 30°С, при которой колонка из различных данного типа сорбента показывала удовлетворительное, эффективное и наиболее воспроизводимое разделение. Выбор данной температуры был обусловлен тем, что повышением температуры, ускоряются все диффузионные процессы, улучшается растворимость соединений, пики становятся более симметричными, повышается селективность разделения, вязкость растворителей уменьшается, сокращается время анализа.

Для эффективности разделения была подобрана и соответствующая колонка Zorbax SВ С₁₈ (3,5mм) 3х150 мм отличающаяся по многим характеристикам от сорбентов подобного типа. Строение частичек сорбента отличается от других фаз тем, что они состоят из субчастиц коллоидных размеров. Именно эта особенность обеспечивает ей самые лучшие механические и химические свойства изо всех известных фаз. Zorbax SВ С₁₈ отличает от других сорбентов очень узкое распределение частиц по размерам, а также самое низкое содержание ионов металлов, которые делают сорбент хроматографически неоднородным, что ведет к уширению пиков. Поэтому применение колонок с сорбентами такого класса позволяет получить симметричные пики разделяемых соединений.

Выбор условий детектирования заключался в подборе оптимального длин волн, соответствующих максимуму поглощения исследуемых алкалоидов. Вторым параметром детектирования, для которого требовался экспериментальный подбор, была величина постоянной времени детектора. Оптимальной считалась такая величина постоянной времени, при которой не наблюдается сглаживание вершин рано элюирующих пиков, и, с другой стороны, достигается максимально возможное подавление регулярной составляющей шума базовой линии, т.е. максимальное соотношение сигнал/шум.

Так как все основные алкалоиды чистотела (протопин, берберин, хелидонин, сангвинарин) относятся к разным подгруппам изохинолиновых производных и имеют гомологичную циклическую структуру, это позволило использовать детектирование на двух длинах волн, предположительно соответствующих их максимуму поглощения 254 и 280 нм, исходя из их циклического строения.

Время продолжительности анализа составляло 15 мин для каждого алкалоида в отдельности и для их суммы. Выбор времени анализа был обусловлен предварительным, экспериментальным прогоном через колонку указанных веществ, результаты которого свидетельствовали в пользу того, что данного количества времени достаточно для осуществления анализа. Время регенерации колонки после разделения каждого соединения входило во временной промежуток анализа, а после окончательного завершения разделения составило 30 мин.

В силу высокой селективности и эффективности в методе был использован флуоресцентный детектор, позволяющий идентифицировать и количественно определять специфическую группу веществ, способных к флюоресценции в силу особенностей своей химической структуры. Это позволило дополнительно увеличить чувствительность и эффективность метода и снять погрешность в достоверности определения исследуемых веществ. Детектирование осуществлялось с использованием указанного детектора при выбранных длинах волн – длина волны возбуждения 280 и длина волны эмиссии 340 нм, а также регистрировался спектр флюоресценции указанных соединений на длинах волн от 320 до 450 нм.

Данные условия метода, использовавшегося для проведения эксперимента, касались всех исследуемых соединений с целью контроля его воспроизводимости. Весь цикл аналитического процесса (включая регенерацию аналитической колонки 50 % элюентом В составляет в среднем 15 мин. Воспроизводимость метода ±1,5%, чувствительность — 5·10^-12 моль. Реагенты готовились на деионизованной воде, которая перед использованием была подвергнута двойной дистилляции.

Результаты, полученные с помощью нового высокоселективного метода, могут быть использованы в диагностике злокачественных новообразований и в оценке эффективности лечения противоопухолевым препаратом Ukrain различных типов раковых патологий.