д-р Запрянова Д.С., доц. д-р Мирчева Т.Г., д-р Динев Т.Г.

Тракийский Университет, Ветеринарномедицинский факультет

6000 Стара Загора, Студентческий городок, Болгария,

Кафедра “ Фармокология, Физиология животных и физиологическая химия”

Влияние некоторых антикоагулянтов и время сохранения концентрации сахара в крови у коз

Определение концентрации сахара в крови является интегральным компонентом рутинной клиничной диагностики в клинично-лабораторной практике. Продвижение в аналитичных технологиях быстро нарастает, но несмотря на эти успехи, интерпретация в данных зависит от ряда факторов, например, стабильности исследованного показателя во время самого исследования. Несмотря на многочисленные публикации, отраженные в научной литературе, об условиях взятия и сохранения пробы до момента её определения, зачастую данные получаются противоречивыми. Ветеринарный биохимик находится в более затрудненном положение в сравнении с биохимиком, занимающимся человеческой медициной, имея ввиду более трудный доступ к информации о видовых различиях, существующих при каждом отдельном виде исследованных животных, и то что в торговой сети готовые реактивы приготовлены для клиничных исследованиях на людях. Это еще более усложняется, когда пробы берутся в территориальных условиях и для них необходим транспорт, чтоб доставить данные пробы в следующую лабораторию. В литературе встречаются данные относительно стабильности глюкозы у некоторых видов животнах, особенно у собак и кошек (12,2) но таких данных о глюкозе у коз мы не смогли открыть в доступной нам литературе. Например, мы не открыли подходящей информации относительно влияния на различные антикоагулянты и стабильности глюкозы во време сохранения у животных, в частности у коз.

Целью нашего исследования было определить до какой степени концентрация сахара в крови у коз зависит от использованного антикоагулянта, как и что этот уровень меняется во време сохранения в холодильных условиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились с 6-ю клинически здоровыми козами Болгарской молочной породы. Козы были нелактирующие (недойные) с живым весом 38,62 ± 3,51 кг. Животных предварительно обеспаразитили. Включенные в эксперимент козы были поставлены в еднаковые условия принятия пищи и отглеждания. Во време проведения опыта на животных, им давали пищу и воду ad libitum. Пробы крови были взяты от каждого животного через пункцию на v. jugularis, перед едой на голодный желодок. Концентрация сахара была исследована в свежей крови, до 2-х часов от взятия, ортотолуидиным методом. Глюкоза определялась в момент взятия (нулевой час), 3-ий час, 6-ой час и 24-ый час. Сохранение крови проводилось в холодильных условиях при температуре до 4 ⁰С. Стабилизация всей крови проводится, когда предварительно в пробирку, в которую возьмут кровь, добавляется противосвертывающее средство и после этого проба хорошо размешивается с добавленным антикоагулянтом. Антикоагулянты, которые были использованы в нашем исследовании это – натриев флуорид (NaF), разтвор гепарина, комплексон и натриев цитрат (С₆H₇O₇Na).

1. Натриего флуорида – 20 mg для 10 ml крови.

2. Комплексоновый разтвор, который мы использовали, получается от 25g комплексона III (динатриева соль этилендиаминтетраоцетатной кислоты, Na₂ЭДТА, Complexon III), 225g дистилированной воды и 25 ml 36% формалина. К 10-ти ml крови добавляем 0,25 ml от этого разтвора.

3. Гепарин, который был использован Heparin “Biochemic” 25000 U/U. Для 2-х ml крови необходим 0,01 ml (10 μl) 1%-ого гепаринового разтвор или 10 mg сухой субстанции.

4. Когда мы использовали натриев цитрат (С₆H₇O₇Na) в качестве антикоагуланта, нам были необходими 40 mg субстанц для 1ml, а натриего флуорида – 20 mg для 10 ml крови. Определение концентрации сахара в крови проводится по ортотолуидиновому методу (9).

Вариационно-статистический анализ был сделан через программу “StatMost for Windows” software (DataMost Co., USA, 1994). При определении статистической достоверности разницы между средними данными отдельных параметров был использован Tukey test.

Таблица 1 А: Концентрация глюкозы (mmol/L) у коз, измеренная в различные периоды по времени в крови, стабилизированной с различными антикоагулянтами.

	Натриев флуорид	Комплексон	Гепарин	Натриев цитрат
0 час	2,96 ± 0,05	2,59 ± 0,11 ^1	2,37 ± 0,07 ^1,2	2,1 ± 0,13 ^1,2,3
3 –ий час	2,34 ± 0,09	2,21 ± 0,08	1,96 ± 0,07 ^1,2	1,65 ± 0,09 ^1,2,3
6 –ой час	1,77 ± 0,05	1,88 ± 0,07	1,58 ± 0,05 ^1,2	1,38 ± 0,02 ^1,2,3
24 –ый час	2,44 ± 0,07	2,18 ± 0,07 ^1	1,91 ± 0,07 ^1,2	1,75 ± 0,12 ^1,2

1,2,3 – статистически достоверная разница между измеренными показателями при Р<0,05

(1-достоверная разница измеренная в сравнении с 0-ым час; 2-разница в сравнении с 3-им часом; 3- разница в сравнения с 6-ым часом)

Таблица 1 В: Концентрация глюкозы (mmol/L) у коз после использования различных антикоагулянтов в различные периоды времени.

	0 час	3 –ий час	6 –ой час	24 –ый час
Натриев флуорид	2,96 ± 0,05	2,34 ± 0,09 ^1	1,77 ± 0,05 ^1,2	2,44 ± 0,07 ^1,3
Комплексон	2,59 ± 0,11	2,21 ± 0,08 ^1	1,88 ± 0,07 ^1,2	2,18 ± 0,07 ^1,3
Гепарин	2,37 ± 0,07	1,96 ± 0,07 ^1	1,58 ± 0,05 ^1,2	1,91 ± 0,07 ^1,3
Натриев цитрат	2,1 ± 0,13	1,65 ± 0,09 ^1	1,38 ± 0,02 ^1,2	1,75 ± 0,12 ^1,3

1,2,3 – статистически достоверная разница между измеренными показателями при Р<0,05

(1- достоверная разница измеренная в сравнении натриего флуорида; 2-разница в сравнение с комплексоном; 3- разница в сравнение с гепарином)

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные нами результаты отражены в таблица 1А и 1В. В данных этой таблицы мы видим, что показатели глюкозы на 0 час при изпользовании на антикоагулянт NaF, а при использовании на натриев цитрат показатели того же часа на 30% ниже, при гепарине на 20% ниже, а при комплексоне – на13%. Содержание глюкозы понижается на 3-ий час и в четырех использованных антикоагулянтах, это продолжается и на 6-ом часу у всех антикоагулянтах от 33 до 40%. Оказывается, что показатели глюкозы 3-его и 24-ого час приблизительно одинаковы.

Употребление натриевого цитрата в нашем эксперименте довело до статистически достоверных (Р<0,05) более низких показателей в сравнении использованного на других антикоагулянтах на 0, 3-ем и 6-ом час. Достоверная разница между первоначальным показанием и другим на 24-ом часу была установлена только при исспользовании комплексона и натриевого флуорида. Показатели глюкозы на 24-ом часу сходна при использовании гепарина и натриевого цитрата. Со своей стороны эти результати 24-ого часа достоверно (Р<0,05) ниже, чем данные от натриевого флуорида и комплексона. Когда мы стабилизировали кровь гепарином, уровень сахара в крови был достоверно (Р<0,05) ниже, чем результаты, полученные с натриевым флуоридом и комплексоном.

При использовании Na₂ЭДТА как антикоагулента в кровяных пробах для определение глюкозы было отчетено, что есть статистически достоверная (Р<0,05) разница в показателях сахара в крови от 0-ого и 24-ого часа только при натриевом флуориде в те же самье часы, но и не при других антикоагулянтах. С другой стороны отмечаем, что уровень глюкозы приблизительно одинаков, тогда как натриев флуорид и комплексон. Самая большая разница получается при употреблении натриевого цитрата. При использовании комплексона в 0-ом часу показатели сахара в крови достоверно (Р<0,05) ниже чем полученные после использования NaF. Когда противосвёртывающее средство гепарин, то показатели достоверно (Р<0,05) ниже тех, при которых использованы NaF и комплексон, а при натриевом цитрате отчитываем самый низкий уровень глюкозы в крови, относительно других трех антикоагулянтов. На 3-ем часу были налицо достоверно (Р<0,05) более низкие показатели глюкозы в сравнение с 0-ым часом и в четырех различных антикоагулянтах. На 6-ом часу после взятия крови достоверно (Р<0,05) ниже уровня глюкозы нулевого и третьего часа. Интересный факт, что на 24-ом часу и при четырех различных антикоагулянтах показатели сахара в крови у коз статистически (Р<0,05) ниже в сравнении с измеренными на 0-ом и 6-ом часу, но и не в 3-ем часу. В третьем часу уровень медленно спадает от использованных нами антикоагулянтов. Позже, на шестом часу нами наблюдается снова достоверное уменьшение показателей в сравнении с исходными концентрациями на 0-ом и 3-ем часу (Табл. 1В).

ОБСУЖДЕНИЕ

В современных условиях определение глюкозы может проводиться сразу же после еë взятия глюкомером, но это измерение очень дорого и нуждается в большой ответственности оператора или ветврача в лаборатории, в результате неправильного использования инструкций в работе, неправильного калибрирования стандартных проб, неправильной чистки аппарата, использования накачественных контрольных материалов, неправильного сохранения ленточек или реагентов и реже необходимого сохранения проб.

Обыкновенно под термином сахар в крови подразумевается само кровяная глюкоза. В крови содержатся и другие сахара – фруктоза, галактоза, малтоза, пентозы и др., но их количество при нормальных физиологических условиях очень низко и практически они не оказывают влиения на концентрацию сахара в крови. Известны несколько других методов: методы основаны на редуцирующем свойстве глюкозы, энзимные и колориметричные методы. Чаще используется, до употребления энзимных методов, ортотолуидиновый метод. Концентрации глюкозы у коз по эtomu metodu от 2,22 до 3,33 mmol/L. Выведение белка из крови проводится с применениам трихлоруксусной кислоты , при условии, что этот процесс начнется не позднее 1-ого часа после взятие крови. Депротеинизорованная кровь храняется несколько дней (5).

В некоторых лабораторных исследованиях (например в определении глюкозы) лучше брать кровь от животного, непосредственно перед исследованием. Когда это невозможно, то эти исследования могут быть сделаны и на стабилизированной с противосвертывающим средством крови. При перестои крови до 24 часов, она должна сохранятся в холодильных условиях при температуре около 4 ⁰С (5). Для более продолжительного времени кровяные пробы сохраняются при температуре под минус 10 ⁰С (5). Антикоагулянтами крови чаще всего используются 1% гепариновый разтвор, комплексонов разтвор, натриев цитрат, натриев оксалат, калиев оксалат, натриев флуорид, хирудин. Для нашего исследования мы выбрали четыре самые употребляемые противосвертывающие средства – гепарин, комплексон, натриев цитрат и натриев флуорид.

В гликолитичной цепи энзим энолаза очень чувствителен к ингибирующему действию на флуору, так что при использовании натриего флуорида берëться во внимание, что он основной антикоагулент и ингибитор распадания глюкозы. Должен бы использоватся, как самый подходящий антикоагулент для определения глюкозного уровня в крови натриев флуорид. По мнению некоторых авторов (7) подходящими противосвертывающими средствами являются гепариновый разтвор и натриев цитрат. Другие считают, что это натриев цитрат, амониев оксалат и калиев оксалат (10).

При определении концентрации сахара в крови коз по орто-толуидиному методу, некоторые авторы (8) советуют использовать ЭДТА как антикоагулент. По мнению других (6,11) при исследовании биохимичных показателей крови у коз, в том числе и глюкозы, как самые подходящие антикоагулянта считаются гепарин и Na₂ЭДТА (динатриева соль этилендиаминтатрауксусной кислоты). В нашем исследовании при употреблении натриевого цитрата мы наблюдаем статистически достоверные (Р<0,05) более низкие показатели в сравнении с использованием других антикоагулянтов на нулевом, третьем и шестом часу. При использовании всех исследованных антикоагулянтов не была найдена большая разница между третьим и двадцатьчетвертым часом. Показатели глюкозы на 24-ом часу более низки (Р<0,05) и приблизительно одинаковые при использовании двух антикоагулянтов гепарина и натриевого цитрата в сравнении с данными при использовании натриевого флуорида и комплексона. Поэтому, когда стабилизируем кровь гепарином нужно иметь ввиду, что уровень сахара в крови, хоть и приблизительно одинаков, но всë же ниже (Р<0,05) в сравнении с результатами, полученными с натриевым флуоридом и комплексоном.

ВЫВОДЫ

1. При использовании NaF как антикоагулента в 0-ом часу уровень сахара в крови у коз статистически (Р<0,05) выше в сравнении с показателями полученными после использования остальных трех противосвëртывающих средств.

2. При продолжительном сохранении кровяных проб, налицо понижение уровня глюкозы, которое наиболее проявляется при использовании натриевого цитрата. Когда используется этот антикоагулянт, то видны статистически (Р<0,05) более низкие уровни сахара в крови в сравнении с другими противосвëртывающими средствами.

3. Концентрация сахара в крови уменьшается с течением времени ( на 3-ем, 6-ом и 24-ом часу). Самое большое понижение кровяных показателей глюкозы отчитываем при использовании натриевого цитрата как противосвëртывающего средства.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Aktas M., Auguste D., Concordet D., Vinclair P., Lefebvre H., Toutain P. L., Braun J. P. Creatine kinase in dog plasma: preanalytical factors of variation, reference values and diagnostic significance. Res. in Vet. Sci. 56, 30-36, 1994.

2. Andreasen J. R., Andreasen C. B., Sonn A. B., Robeson D. C. The effects of haemolysis on serum chemistry measurement in poultry, Avian Pathol. 25 (3), 519-536, 1996.

3. Fraser C. G., Williams P., Short-term biological variation of plasma analytes in renal disease, Clin. Chem. 29/3, 508-510,1983.

4. Hrubec T. C., Whichard J. M., Larsen C. T., Pierson F. W. Plasma versus serum: Specific differences in biochemical analyte values, Journal of avian medicine and surgery, 16(2), 101-105, 2002.

5. Ibrishimov N., Lalov H., Klinichno-laboratorni izsledvania vav veterinarnata medicina, Zemizdat, Bulgaria 1974.

6. Jones D. G., Stability and storage characteristics of enzymes in cattle blood, Research of Veterinary Science, 38, 301-306, 1985.

7. Morton D. B., Abbot D. et al. Removal of blood from laboratory mammals and birds, Laboratory animals 27, 1993.

8. Nazifi S., Dehghani S., Gheisari H.R. Biochemical and cytologic properties of blood and peritoneal fluid in clinically normal adult goats, Veterinarski Arhiv 69(4), 221-227, Iran, 1999.

9. Popov Ch., Dishlyanova E. Practical book in biochemistry, Zemizdat-Sofia, 1993.

10. Ryan W.L. Simulatet human platelets from red blood ceels. US Patent Issued 5008201, 1991.

11. Taiwo V.O., Ogunsanmi A.O. Haematology, plasma, whole blood and biochemical values of clinically healthy captive-reared grey duiker and west african dwarf sheep and goats, Izrael Vet Med Ass. Vol 58(1), 2003.

12. Thoresen S. I., Havre G. N., Morberg H., Mowinckel P., Effects of storage time on chemistry results from canine whole blood, heparinized whole blood, serum and heparinized plasma, Vet. Clin. Pathol. 21(3), 88-94, 1992.