Биологические науки/6. Микробиология

Аспирант Пойдунов Д.Н., научные руководитель к.б.н., доцент Макаревич Е.В.

ФГОУВПО «Мурманский государственный технический университет», Россия

Сравнительный анализ методов количественного учета бактериобентоса

При учете бактериальных клеток прямым микроскопическим методом достоверный подсчет их количества является одним из важнейших моментов. Завышение или занижение величин количественных характеристик бактериобентоса может привести к неадекватной оценке его структурной и функциональной роли в водоеме. Результаты определения общей численности бактерий существенным образом зависят от методов, использованных для подсчета бактерий. Поэтому подбор оптимальных и наиболее объективных методов является первостепенной задачей.

К настоящему времени накоплен некоторый материал по численности бактериобентоса морских водоемов. Выработан целый ряд стратегий при исследовании микроорганизменных сообществ. В литературе встречаются работы по сопоставлению результатов по определению численности микроорганизмов различными способами, но они проводились главным образом при исследовании бактериопланктона, в то время как подобные исследования при изучении бактериобентоса имели эпизодический и отрывочный характер.

В связи с этим в 2003-2008 гг. на литорали Кольского залива были предприняты исследования структурных показателей бактериобентоса разными методами. Во-первых, сравнивались определения плотности бактерий с помощью эпифлуорисцентной микроскопии и метод прямого счета А.С.Разумова. А также использовались различные методы десорбции прикрепленных к частицам грунта бактерий: ультразвук, гомогенизация и обработка проб 0,0004 н раствором NaOH.

В результате проведенных исследований было установлено, что численность бактерий в пробах, обработанных щелочью на фильтрах, окрашенных эритрозином, варьировали от 10,85·10⁴ до 1974,4·10⁴ кл/см², а на окрашенных акридином – от 4,96·10⁴ до 673,75·10⁴ кл/см². Результаты подсчета бактериальных клеток на фильтрах, окрашенных эритрозином, были в среднем в 2,84 раза выше, чем на фильтрах окрашенных акридином. Величины численности бактерий в пробах, обработанных ультразвуком на фильтрах, окрашенных эритрозином, варьировали от 34,91·10⁴ до 7485,94·10⁴ кл/см², а на окрашенных акридином – от 16,16·10⁴ до 2654,58·10⁴ кл/см². Результаты подсчета бактериальных клеток на фильтрах, окрашенных эритрозином, были в среднем в 2,53 раза выше, чем на фильтрах окрашенных акридином.

Для сопоставления результатов сравнения методов обработки проб раствором NaOH и ультразвуком при определении численности бактерий в грунте рассчитывали коэффициенты сравнения методов обработки проб Кэ и Кл (табл.1, 2). Где Кэ - отношение абсолютных значений численности микроорганизмов, полученных методом прямой микроскопии с использованием эритрозина при десорбции бактериальных клеток ультразвуком к значениям, полученным тем же способом микроскопирования при обработке проб раствором NaOH. Кл - коэффициент сравнения вышеуказанных методов обработки проб, при определении числа бактерий в грунте методом люминесцентной микроскопии.

Таблица 1

Статистическая обработка коэффициента сравнения (Кэ).

n, количество измерений	X min	X max	δ	Xср± SE	CV,%
24	2,88	5,05	0,56727	3,56±0,12	16

Таблица 2

Статистическая обработка коэффициента сравнения (Кл)

n, количество измерений	X min	X max	δ	Xср± SE	CV,%
24	2,99	4,58	0,39888	3,97±0,08	10

При применении метода прямого счета бактерий с окраской эритрозином было установлено, что грунт, обработанный ультразвуком содержит в 3,56 раза больше бактерий, чем грунт, обработанный 0,0004 н раствором NaOH. При учете бактерий люминесцентным методом это соотношение составило 3,97 раза. Полученные результаты демонстрируют более полную десорбцию бактериальных клеток при использовании ультразвука, независимо от размерных характеристик частиц грунта.

Для сравнения данных о численности бактерий в грунте, обработанном для десорбции клеток раствором NaOH и ультразвуком, устанавливали коэффициенты сравнения методов обработки грунта Кщ и Ку (табл. 3 и 4). Кщ - отношение абсолютных значений численности микроорганизмов, полученных методом прямой микроскопии с использованием эритрозина к значениям, полученным методом люминисцентной микроскопии при обработке проб раствором NaOH. Ку - коэффициент сравнения вышеуказанных методов обработки проб, при определении числа бактерий в грунте при десорбции микроорганизменных клеток ультразвуком.

Таблица 3

Статистическая обработка коэффициента сравнения методов определения ЧБ с обработкой проб раствором NaOH (Кщ)

n, количество измерений	X min	X max	δ	Xср± SE	CV,%
24	2,19	3,27	0,25377	2,84±0,05	9

Таблица 4

Статистическая обработка коэффициента сравнения методов определения ЧБ с обработкой проб ультразвуком (Ку)

n, количество измерений	X min	X max	δ	Xср± SE	CV,%
24	1,78	3,1	0,32076	2,53±0,07	13

Проведенные нами и другими исследователями экспериментальные работы по сравнению разных методов окрашивания бактерий и десорбции бактериальных клеток с частиц грунта, дают право вносить соответствующие поправки в данные по общей численности бактерий для их коррекции. После введения таких поправок становится возможным сопоставлять результаты собственных исследований с литературными данными.

ВЫВОДЫ:

1. Методические экспериментальные исследования показали, что при определении численности бактерий различными методами, предварительная обработка проб грунта ультразвуком позволяет наиболее достоверно учесть количество микроорганизмов, вследствие более полной десорбции бактериальных клеток с грунтовых частиц.

2.На основании сравнительного анализа используемых в работе методов отмечено, что для получения точных результатов наиболее оптимальным методом определения численности бактерий в грунтах является метод люминесцентной микроскопии.