Показатели апоптоза, как критерии адекватности выбранной терапии при лечении склеродермии

Г.В. Николашин, Л.П. Колбасина, П.Н. Колбасин, А.А. Писарев

Крымский Государственный Медицинский Университет

им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь

Склеродермия относится к распространенным хроническим заболеваниям
соединительной ткани из группы системных болезней соединительной ткани. Системная
форма склеродермии протекает с поражением внутренних органов. Очаговая (органическая)
склеродермия представляет собой локализованную кожную форму заболевания без
признаков системности процесса и составляет около 0,3% в общей структуре дерматозов
Тенденция к увеличению заболеваемости, социальная значимость проблемы в связи с
частым поражением лиц среднего трудоспособного возраста и возможной инвалидностью,
торпидное рецидивирующее течение определяют актуальность дальнейшего изучения
теоретических и практических аспектов этой патологии.

Взаимодействие многообразных патогенетических факторов в развитии заболевания
осложняет выбор методов лечения и, очевидно, снижает порой их эффективность. При
стабилизации патологического процесса с тенденцией к разрешению индурации и склероза
показаны ферментные препараты, иммуномодуляторы (цикло ферон), спазм политики,
биостимуляторы. Усиливают и закрепляют лечебный эффект, а также, оказывают
реабилитационное воздействие лечебной грязи.

Целью данного исследования явилось изучение состояния апоптоза в зависимости от
сроков заболевания склеродермии

Материалы и методы

Главным проявлением апоптоза является деградация хроматина. Ее основой служит
ферментативное расщепление ДНК. Оно происходит в несколько этапов с формированием
все более мелких фрагментов. Сначала образуются фрагменты, включающие 700, 200-250,
50-70 тыс. пар оснований, затем - фрагменты, содержащие 30-50 тыс. пар оснований. На
этой стадии происходит конденсация хроматина и инвагинации ядерной мембраны. После
реализации этого этапа процесс становится необратимым. Затем наступает очередной этап
деградации, который хорошо изучен и служит наиболее широко принятым
опознавательным признаком апоптоза — это межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т. е.
разрывы нитей ДНК, находящихся между нуклеосомами. При этом образуются фрагменты,
кратные по величине 180-190 пар оснований, что соответствует протяженности нити ДНК в
пределах одной нуклеосомы. Этот тип деградации обычно завершается в течение суток. При
всей типичности для апоптоза этого типа расщепления ДНК известны примеры, когда
процесс ограничивается образованием более крупных фрагментов.

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, зависящим от
температуры, источников энергии, синтеза РНК и белка йе почо. Различные этапы
деградации ДНК катализируются разными формами эндонуклеаз, отличающимися
субстратной специфичностью и условиями проявления активности (см. ниже).

Несмотря на безусловно ключевую роль деградации ДНК в осуществлении апоптоза.
между этими процессами нельзя поставить знак равенства. Во-первых, морфологические и
биохимические изменения в цитоплазме и мембранах, характерные для апоптоза ~снижение
трансмембранного потенциала митохондрий, накопление реактивных форм кислорода и т.
д.), могут бьпъ индуцированы в энуклеированных клетках, т. е. в ситуации, когда
деградация хроматина не происходит в связи с его отсутствием. Во-вторых, не разрушение
ДНК и прекращение работы генов являются непосредственной причиной смерти клетки при
апоптозе, поскольку их последствия сказываются несколько позже того срока, когда
наступает апоптотическая гибель клетки. Предполагают, что гибель наступает из-за
энергетического голода, вызванного расходованием АТФ на работу по репарации
поврежденной ДНК.

Методы выявления апоптоза разнообразны. Ориентировочная идентификация апоптоза
возможна на основании вьппеназванных морфологических признаков. Более доказательные
подходы в большинстве случаев основаны на выявлении формирующихся разрывов ДНК, ее
деградации и потери клеткой части генетического материала. Чаше всего используют
электро форетическое разделение полидез оксирибонуклеотидных фрагментов,
экстрагируемых из клеток: фрагменты образуют характерную "лесенку (серию прерывистых полос), отражающую дискретный характер межнуклеосомных разрывов.

Другие методы основаны на катализируемом терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансф еразой синтезе олигонуклеотидов из меченых предшественников и их встраивании в ДНК через ее свободные концы, формирующиеся в участках разрывов. Встраивание меченых олигонуклеотидов затем выявляется с помощью цитофлюорометрических или морфологических методов —TUNEL (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labelin) или ISEL (in situ end-labelin). В настоящее время широко распространяется цито флюорометрический метод выявления апоптотических клеток, основанный на утрате ими части хроматина. При этом клетки обрабатывают йодидом пропидия, который проникает в апоптотические клетки и взаимодействует с ДНК, и подвергают их проточной цитофлюорометрии, выявляя долю клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. Иногда параллельно используют другие красители для одновременного выявления некротизированных клеток. На регистрации снижения трансмембранного потенциала митохондрий основан метод регистрации апоптоза по изменению окрашивания липофильными катионными флуорохромами (например, родамином или йодидом дигексилоксикарб оцианина), тропными к внутренней поверхности митохондриальной мембраны.

Как следует из анализа полученных данных, у больных очаговой склеродермией имело
место усиление апоптоза (повышение уровня СD95 позитивных лимфоцитов и Рs).

Исследуя корреляционные связи между уровнем показателей клеточного иммунитета и
показателями апоптоза, мы обратили внимание на наличие тесной обратной
корреляционной связи (г > -0,5) между показателями клеточного иммунитета (уменьшение
количества СОЗ+, СО4+) и показателями апоптоза (рост СD95 и Annexin V). Данная
обратная корреляционная связь отражает степень деградации клеточного иммунитета.
Имеет место интенсификация процессов апоптоза за счет гибели клеток СDЗ+ и СD4+.

Анализируя показатели цитокинового звена иммунитета в зависимости от длительности
заболевания, следует отметить, что уровень ФНО-а у больных с различной давностью
процесса был достоверно (р < 0,05) выше, чем у здоровых, причем наиболее низкие
показатели были у больных с продолжительностью процесса менее одного года и самые
высокие показатели — при длительности заболевания более 5-ти лет. Отмечена
закономерность, связанная с увеличением уровня ФНО-а у больных по мере увеличения
продолжительности процесса (обнаружена обратная корреляционная связь средней силы
между длительностью заболевания и уровнями ФНО-а (г = -0,47; Р < 0,05).

Аналогичная картина наблюдалась у больных и по содержанию ИФ-а и ИФ-у. Их уровни
были выше показателей здоровых лиц и наибольшие изменения отмечались у пациентов с
большей давностью заболевания.

Нами также была обнаружена обратная корреляционная
связь средней силы между длительностью процесса и уровнями ИФ-а (г = -0,49; Р < 0,05) и
ИФ-у (г = -0,47; Р < 0,05) у больных очаговой склеродермией.

Результаты и их обсуждение

Благоприятная динамика со стороны патологического процесса начинала проявляться
уже к середине второй недели от начала лечения. Улучшилось общее состояние больных,
уменьшились парестезии, зуд, онемение в очагах поражения, постепенно уменьшались
воспалительные явления в отечно-эриматозной фазе. В стадии индурации кожа становилась
мягче, эластичнее, легче бралась в складку, начали намечаться участки атрофии. К концу
курса лечения у всех больных основной группы констатирована различная степень
клинического улучшения. Наилучшие результаты получены у больных бляшечной формой
склеродермии, особенно при локализованном процессе - клиническая ремиссия у 30,0%
больных в сравнении с 16,7% при распространенном (различия достоверны р<0,01),
значительное улучшение, соответственно в 55,0% и в 16,7% случаев (р<0,05).

В группе больных со склероатрофическим лихеном клиническая ремиссия достигнуты в
9,1% случаев, значительное улучшение - в 36,4%. Эти результаты были значимо ниже, чем у
больных бляшечной локализованной формой склеродермии.

Линейная форма склеродермии оказалась более резистентной к проводимой терапии,
значительное улучшение отмечено лишь в 28,6% случаев по сравнению с 55,0% у больных
локализованной бляшечной склеродермией, (р<0,05).

При поверхностной склеродермии Гунберо и атрофодермии Пасси-ни-Пьерини ввиду
малого количества наблюдений интерпретировать результаты лечения затруднительно.

Анализируя эффективность комплексного лечения в зависимости от активности
склеродермия-ческого процесс, мы установили, что клинической ремиссии в стадии,
эритемы удалось достичь к концу курса лечения только у одной больной с единичнымии
очагами (12,5%). У остальных пациентов этой группы дольше сохранялась воспалительная
реакция в виде покраснения и отечности в центре очагов и фиолетового ободка по
периферии. Значительное улучшение зарегистрировано у 4 больных (26,7%), улучшение - у
9 (60,0%), незначительное улучшение у 3 (33,3%), (р<0,05). Более высокие результаты
получены у больных, находившихся в стадии индурации, после затухания активности
процесса. Уплотнение в очагах поражения полностью исчезло (клиническая ремиссия у 7
(29,2%) больных, сохранялись остаточные явления индурации (значительное улучшение) у
11 (15,9%) частичная индурация (незначительное улучшение) оставалась у 2 (8,3%)
больных.

У пациентов, составивших третью группу (стадия атрофии) изменения в
склеродермических очагах были незначительно, сохранялась стойкая атрофия. У этих
больных имелось и некоторое уплотнение кожи, которое в динамике лечения уменьшалось.
Улучшение отмечено у 2 (33,4%), незначительное улучшение у 4 (66,0%) больных.

Таким образом, результаты терапии находились в четкой зависимости от активности
склеродермического процесса. Лечение, проводимое в период индурации, оказалось более
эффективным, чем в острой и подострой стадии при наличии воспалительной активности и
преобладании кожной эритемы, атрофия же изменялась мало.

Важным показателем эффективности лечения также являются отдаленные результаты.
Динамическое наблюдение за пациентами основной группы (42 человека) и группы
сравнения (36 человек) показало, что стойкий терапевтический эффект (клиническая
ремиссия) сохранялся соответственно у 14 (33,3%) и у 7 (19,4%) больных. Через несколько
месяцев после окончания лечения у трех больных основной группы индурация полностью
исчезла и перешла в атрофию, а у двух уплотнение кожи разрешилось бесследно, без исхода
в атрофию. Эти 5 (11,9%) больных были переведены в подгруппу "клиническая ремиссия".
В группе сравнения была только одна такая больная (2,7%).

Таким образом, предложенная комплексная терапия приводит к быстрому выраженному
улучшению и позволяет достичь стойкой ремиссии.