Карабутін О.С., студент, Черевач Н.В., к.б.н., доцент, Середня Ю.В., бактеріолог.

Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара

ОСОБЛИВОСТІ ВИДІЛЕННЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЇ МІКОБАКТЕРІЙ

Туберкульоз залишається однією з найбільш поширених інфекційних хвороб. Згідно з даними ВООЗ щороку в світі виявляють від 7 до 10 млн. осіб, які вперше захворіли на туберкульоз, а помирає від нього майже 3 млн. чоловік. Загальна кількість хворих на туберкульоз становить 50-60 мільйонів. Ця соціально небезпечна інфекційна хвороба стала проблемою для багатьох країн світу, у тому числі й для України.

В Україні, починаючи з 1995 року, зафіксована епідемія туберкульозу, яка невпинно прогресує і є однією з основних медико-соціальних проблем. Відбувається поширення усіх форм туберкульозу. На сьогодні зареєстровано близько 700 тис. хворих, що становить 1,4% чисельності населення країни. Епідемія невпинно прогресує і набуває погрозливих масштабів. Статистика свідчить про те, що в Україні щоденно реєструється 82 нових хворих на туберкульоз, а 30 хворих помирає.

Метою даної роботи було вивчення біологічних властивостей мікобактерій, виділених із клінічного матеріалу, отриманого від осіб з діагнозом туберкульоз легень. Робота виконана на базі баклабораторії протитуберкульозного диспансеру м. Дніпропетровська.

В завдання роботи входило:

- виділення культур мікобактерій з патологічного матеріалу;

- визначення чутливості виділених культур до протитуберкульозних препаратів.

Із обстежених 408 пацієнтів з попереднім діагнозом туберкульоз легень було відібрано 120 осіб, у яких була зареєстрована наявність кислотостійких бактерій (КСБ) при бактеріоскопічному дослідженні мокротиння за методом Ціля-Нільсена та встановлено діагноз туберкульоз легень за результатами рентгенологічного обстеження. Із 120 осіб – 50 було з діагнозом ВДТБ (вперше діагнозтований туберкульоз), 10 – РТБ (рецидив туберкульозу), 9 – ХТБ (хронічний туберкульоз), 51 – ХТБ" (пацієнти з перерваним процесом лікування, але з відомим збудником). Згідно наказу № 45 МОЗ України від 06.02.2002р. «Про затвердження Інструкції з бактеріальної діагностики інфекції» від кожного пацієнта відбирали по 3 зразки клінічного матеріалу, оскільки бактеріовиділення є епізодичним процесом, який характеризується різним ступенем інтенсивності виділення.

В ході роботи від 120 пацієнтів було отримано – 207 ізолятів зразків клінічного матеріалу для подальшого бактеріологічного дослідження. Матеріал висівали на селективні середовища Льовенштейна-Єнсена та Фінн II.

Відбір культур відбувався за показниками ознак, характерних для комплексу Мyсobacterium tuberculosis.

Таблиця № 1

Культуральні ознаки комплексу М.tuberculosis

Культуральні ознаки	Комплекс М.tuberculosis
Швидкість росту	Ті, що повільно ростуть > 3 тижнів
Пігментоутворення	Колір слонової кістки, колір «шкіри молодого бичка»
Морфологія колоній	R чи S форми
Наявність кислотостійкості	Виражене кислотостійке фарбування
Температура росту	Оптимальний ріст при 35 - 37 ⁰ С

Додатково було проведено визначення наявності cord-фактору (ознака патогенності) та росту в присутності PNB (500 мкг/мл).

При висівах на селективні середовища Льовенштейна-Єнсена та Фінн II бактеріальний ріст було зареєстровано у зразках від 115 осіб (92%). Матеріал, отриманий від 5 осіб не дав росту на жодному середовищі, незважаючи на те, що в мазках від цих осіб було виявлено значну кількість кислотостійких бактерій.

Згідно методичних рекомендацій МОЗ України контроль росту ізолятів проводився кожні 7 діб (візуально) на протязі 6-16 тижнів. За характером росту визначили швидкість росту культури. Наявність або відсутність пігментоутворення, наявність корд-фактору, ріст на середовищі з паранітробензойною кислотою у концентрації 500 мкг/мл.

Із загальної кількості висіяних проб 92% дали ріст культури на обох селективних середовищах, 4% дали ріст тільки на середовищі Льовенштейна-Єнсена, і 4% - на Фінн-ІІ. Також було з’ясовано, що із загальної кількості ізолятів при наявності кислотостійких бактерій (КСБ) у мазку дали ріст 108 ізолятів, що становить 56% від загальної кількості ізолятів, які дали ріст, і 83 ізоляти дали ріст при відсутності КСБ у нативному мазку, що становить 44% ізолятів, які взагалі виросли, а також відповідає 90,2% від загальної кількості усіх мазків, у яких не було виявлено КСБ. Це свідчить про те, що бактеріологічний метод дослідження є більш чутливим при ідентифікації, ніж бактеріоскопічний.

В ході дослідження усіх ізолятах, які дали ріст, було зафіксовано наявність корд-фактору (рис. 1).

Рис. 1 Корд-фактор свіжої культури М.tuberculosis (фарбування за

методом Ціля-Нільсена).

У 97,4% ізолятів культур пігментоутворювання не відбулося. Це відповідає патогенному комплексу М.tuberculosis. При використанні додаткового тесту (ріст на середовищі з PNB) було досліджено 88 ізолятів і з’ясовано, що всі вони дали негативний результат, що теж властиво для патогенних мікобактерій. Всі культури росли повільно від 6 до 16 тижнів, що теж є ознакою мікобактерій туберкульозу, і утворювали шорсткі (R-форма), злегка кремово – жовтуваті колонії у вигляді хлібних крихт або цвітної капусти.

Таким чином, властивості усіх досліджених ізолятів відповідали комплексу ознак патогенних мікобактерій.

Згідно протоколу дослідження, наступним етапом дослідження було визначення медикаментозної стійкості (резистентності), виділених культур до антимікобактеріальних препаратів (АМБП) I та II рядів, які використовуються при схемах лікування різних форм перебігу хвороби (рис 2 та 3). До I ряду АМБП відносяться: ізоніазид, етамбутол, рифампіцин, стрептоміцин, так як вони найбільш активні до збудників туберкульозної інфекції. До II ряду відносяться капріоміцин, офлоксацин, канаміцин, этіонамід, ПАСК. Ці препарати мають менш у бактеріостатичну активність, але більш виражену токсичну дію. При встановленні резистентності до препаратів I ряду визначили чутливість культур до препаратів II ряду. Резистентність або чутливість культур, що дали ріст, визначали згідно методики, викладеної в наказі № 45 МОЗ України від 06.02.2002р.

Визначення резистентності культур до антимікобактеріальних препаратів І ряду показало, що найбільше резистентних культур було виявлено до препаратів ізоніазид (Н) та стрептоміцин (S) при всіх формах захворювання (рис 2).

Також було з’ясовано, що 20% (23 особи) мають резистентність до всіх препаратів 1 ряду. Дев’ять пацієнтів належали до групи ВДТБ, тобто при вперше діагностованому туберкульозі виділяються культури з полі резистентністю.

Резистентність до препаратів ІІ ряду була наступною: до канаміцину – 48% культур, ПАСК – 13%, офлоксацину – 43%, капріоміціну – 30%, ЕТА (етіонамід) – 22% (рис 3). Із 23 культур 15 виявилися резистентними і до другого ряду препаратів.

Таким чином, згідно отриманих даних найвищу чутливість виділені культури мали до препарату ПАСК, незважаючи на те, що він використовується у лікуванні туберкульозної інфекції понад 50 років. Слід відзначити, що найбільша кількість резистентних культур була виділена від пацієнтів з хронічною формою перебігу хвороби і є наслідком неефективності лікування патологічного процесу.

Отримані дані можуть бути використані для ідентифікації мікобактерій, виділених із клінічного матеріалу, та складані схем лікування пацієнтів з різними формами перебігу хвороби.

ПЕРЕЛІК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ:

1. Вінніков А.І.Санітарна мікробіологія: Навч. посібник. А.І. Вінніков, Н.В. Черевач, Т.М. Полішко, О.В.Крисенко, Т.В. Скляр - Д: Вид-во Дніпропетр. нац. ун-ту, 2006-300.

2. Закон України "Про боротьбу із захворюванням на туберкульоз", 2001.

Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції (наказ МОЗ України № 45 від 06.02.02 р. "Про заходи щодо покращення бактеріологічної діагностики туберкульозу в Україні").

3. Мельник В.М., Хіміорезистентний туберкульоз / Фещенко Ю.І., Мельник В.М., Коблянська А.В. - К.: Здоров'я, 2003. - 136 с.

4. Микроскопия кислотоустойчивьіх микобактерий— Женева, ВОЗ, 2000 — 41с. Наказ МОЗ України № 610 від 15.11.05р. "Про впровадження в Україні адаптованої ДОТС - стратегії".

5. Савула М.М., Туберкульоз/ Савула М.М., Ладний О.Я. Тернопіль «Укрмедкнига», 1999р.

6. Фещенко Ю.І.., Ільницький Г.Г., Мельник В.М., Панасик О.В, Туберкульоз позалегеневої локалізації. — К.: Логос, 1998. — 380 с.

7. Фещенко Ю.І.., Мельник В.М. Сучасні методи діагностики, лікування і профілактики туберкульозу. — К.: Здоров'я, 2004. — 904 с.

8. Фещенко Ю.І., Мельник В.М. Туберкульоз легень у період епідемії: Епідеміологічні, клініко-діагностичні, лікувально-профілактичні та організаційні аспекти. — К.: Логос, 1998. — 284 с.

9. Фещенко Ю.І. Фтизіоепідеміологія/ Фещенко Ю.І., Мельник В.М. Київ «Здоров'я» 2004р.