УДК 612.824.1:611.451:599.323.4:611:616-076

Морфофункциональные изменения надпочечников неполовозрелых белых крыс при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости.

В.В. Киселев, Н.К. Каширина

Кафедра нормальной анатомии человека ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И.Георгиевского» (заведующий кафедрой д.м.н., профессор В.С. Пикалюк), г. Симферополь.

В настоящее время внимание многих исследователей направлено на изучение свойств различных компонентов живых организмов с целью поиска биологически обоснованных методов коррекции патологических состояний. В связи с этим, нельзя обойти стороной такой ценный биологический субстрат, каким является спинномозговая жидкость (СМЖ), которая, будучи биологической средой нервной системы и широко участвуя в процессах регуляции нейроэндокринных взаимоотношений, обладает уникальными биологическими свойствами [1]. На первых этапах изучения состава и биологических свойств аллогенной, а затем и ксеногенной СМЖ, инфузии ее показывали зачастую высокую степень коррекции различных патологических состояний. В дальнейшем применяться стала преимущественно ксеногенная СМЖ [2], донором которой чаще всего являлся крупный рогатый скот, в связи со значительным сходством свойств его спинномозговой жидкости с СМЖ человека [3]. Серии экспериментов доказали отсутствие как тератогенных, эмбриотоксических свойств КСМЖ, так и иммунопатологических реакций после введения КСМЖ [4]. В настоящее время на базе кафедры нормальной анатомии человека Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского проводится ряд доклинических исследований in vivo по изучению свойств ксеногенной спинномозговой жидкости (КСМЖ), которая рассматривается как возможное перспективное сырье для производства нового иммунобиологического препарата [5]. В настоящем исследовании изучены морфофункциональные изменения надпочечных желез, как ключевого органа стресс-реализующей системы нейроэндокринного аппарата организма высших млекопитающих, включая и человека.

Материал и методы. Спинномозговую жидкость получали субокципитальной пункцией от лактирующих коров в стерильную полузакрытую систему по методу [6], проводили через бактериальные фильтры «Миллипор» и запаивали в ампулы. Для эксперимента были отобраны белые крысы-самцы линии Вистар 4 в возрасте 1 месяца, которые относят к неполовозрелым (инфантильным). Они составили серию II. КСМЖ или плацебо (физраствор) вводили трехкратно с интервалом в два дня. Животных выводили из эксперимента с соблюдением методов биоэтики на 7-е и 30-е сутки от момента введения КСМЖ (путем декапитации под эфирным наркозом). Материал для исследования – надпочечники, выделяли, взвешивали на торсионных весах с точностью до 0,1 мг, определяя абсолютную массу органов (мг), измеряли в трех плоскостях, определяли их объем (мм³), затем правый фиксировали в 10% растворе формалина, изготавливали гистологические срезы по общепринятым методикам, окрашивали их гематоксилин-эозином. Для электронномикроскопического исследования надпочечные железы фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида и дофиксации в 1% растворе OsO4 заливали в эпон-аралдитовые блоки. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Морфометрическое исследование проведено с помощью оптического анализатора изображения “OLYMPUS” и программы «ImageJ». Методами морфометрии определяли толщину коры и мозгового вещества надпочечника на срединном срезе, соотношение толщины зон коркового вещества железы, площадь поперечного сечения клеток и их ядер, вычисляли площадь сечения цитоплазмы, величину цитоплазматически-ядерного индекса (Ind cyt/nucl). Степень достоверности полученных данных определяли методом вариационной статистики. Электронномкроскопическое исследование проведено на электронных микроскопах ПЭМ 100.

Результаты. Неполовозрелым контрольным животным вводили 3 раза плацебо в виде физраствора и выводили из эксперимента в возрасте 1 месяц 7 суток. Эти крысы составили контрольную группу серии II (К7-II). Неполовозрелые крысы-самцы, которым в 1-месячном возрасте 3-кратно вводили СМЖ с интервалом в 2 суток и затем выводили из эксперимента в возрасте 1 месяц 7 суток, сформировали экспериментальную группу серии II (Э7-II). Биометрическим исследованием установлено достоверное увеличение массы надпочечных желез и их объема после введения КСМЖ. Однако относительная масса и удельный вес органа существенно не изменялся по сравнению с данными контроля (табл.1).

Таблица 1.

Биометрия надпочечных желез крыс.

Серия	Масса животного, (г)	Масса органа, (г)	Относительная масса, ‰	Удельный вес, мг/мм^3	Объем, (мм^3)
К7-II	41,17±4,62	3,68±0,51	0,09±0,02	0,91±0,05	4,06±0,58
Э7-II	44,00±2,83	4,90±0,54*	0,11±0,01	0,95±0,03	5,16±0,55*

*р≤0,05

Введение КСМЖ вызывает уменьшение толщины капсулы надпочечных желез как за счет уменьшения числа рядов клеток фибробластического дифферона до 3-4 рядов (вместо 4-5 в контроле), уплощения клеток, так и за счет уменьшения содержания соединительнотканных волокон в капсуле.

Общая толщина коркового вещества у неполовозрелых контрольных крыс составляет 808,81 ± 56,44 мкм, а толщина клубочковой, пучковой и сетчатой зон – соответственно 12,27%, 63,74% и 23,75% от толщины коры надпочечных желез. Введение КСМЖ обуславливает достоверное возрастание толщины коркового вещества на 20,23% (938,78±71,82 мкм). Этот процесс сопровождается разнонаправленными изменениями толщины различных зон коры: значительно уменьшается толщина клубочковой зоны – на 25,38% (74,38±6,32 мкм), толщина сетчатой зоны снижается меньше – на 12,51% (170,43±11,24 мкм), тогда как толщина пучковой зоны резко увеличивается – на 41,87%, составляя 734,30±37,17 мкм. Одновременно выявляется расширение сосудов гемомикроциркуляторного русла и умеренное увеличение площади сосудистого русла в корковом веществе надпочечных желез.

Клубочковая зона у контрольных животных образована тяжами кортикоцитов, формирующих четко различимые клубочки и арки. Значительная часть клеток паренхимы содержит крупные ядра и ядрышки, имеющие вид «тутовой ягоды», много ядерных пор, плотное расположение рибосом на наружной ядерной мембране, а также хорошо развитые органеллы стероидогенеза в цитоплазме, имеющие типичные особенности для клубочковой зоны (рис.1), что по данным гисторадиоавтографии надпочечных желез указывает на высокую активность синтеза РНК в кортикоцитах [7].

При введении КСМЖ клубочковая зона не только уменьшается по толщине, в ней встречаются участки с нарушением морфогенеза, где кортикоциты формируют пластообразные скопления, расположенные параллельно наружной капсуле органа (рис.2).

Среди клеток паренхимы доминируют более мелкие и более уплощенные кортикоциты с небольшим уплощенным ядром, гиперхромией кариоплазмы, мелкими ядрышками, уменьшением числа ядерных пор, снижением числа рибосом на наружной ядерной мембране и умеренными дистрофическим изменениями органелл в цитоплазме (деструкцией крист митохондрий и части мембран АЭПС, формированием небольших вакуолей, снижением содержания полирибосом). Указанные изменения сопровождаются выраженной тенденцией к снижению размеров кортикоцитов, достоверным уменьшением их ядер (табл. 2), что в совокупности с указанными выше изменениями может свидетельствовать об угнетении функциональной активности кортикоцитов клубочковой зоны.

При введении КСМЖ переходная зона уменьшается по толщине, состоит из 1-2 рядов мелких темных уплощенных кортикоцитов, а на значительных участках коркового вещества и вовсе отсутствует.

Пучковая зона контрольных неполовозрелых животных образована радиально расположенными тяжами кортикоцитов, имеющими наиболее крупные размеры и полигональную форму. Ультраструктурные особенности строения ядер кортикоцитов и их цитоплазмы (преобладание эухроматина, крупные ядрышки, множество рибосом на кариолемме, плотное заполнение цитоплазмы многочисленными митохондриями, полирибосомами, везикулами АЭПС, значительное число диктиосом комплекса Гольджи, липосом с преимущественной локализацией последних в околоядерной зоне) свидетельствуют о способности клеток к осуществлению активного синтеза специфических стероидных гормонов в пучковой зоне.

После введения КСМЖ в пучковой зоне наиболее значительно выражено расширение гемокапилляров, утолщение и разволокнение соединительнотканных перегородок, умеренный отек и гидропическая дистрофия эндотелиоцитов гемокапилляров. Отдельные кортикоциты подвергаются баллонной дистрофии, гибели и на их месте выявляется скопление клеток фибробластического дифферона.

Среди кортикоцитов пучковой зоны (рис.3) выявляются светлые и темные клетки, число темных клеток возрастает. Дистрофические изменения по типу гидропической дистрофии более выражены в светлых клетках паренхимы и сопровождаются частичной деструкцией крист митохондрий, формированием мелких вакуолей в результате разрыва везикул АЭПС, цистерн комплекса Гольджи. Липосомы немногочисленны, опустошенные. Темные кортикоциты пучковой зоны отличаются лучшей сохранностью всех органелл стероидогенеза в цитоплазме, наличием крупных и более многочисленных ядрышек в ядрах, что свидетельствует о больших функциональных возможностях этих клеток.

Значительно возрастает площадь поперечного сечения кортикоцитов: в верхней части пучковой зоны площадь клеток возрастает в 1,41 раз и преимущественно увеличивается площадь цитоплазмы (в 1,52 раза), а в средней части зоны площадь сечения клеток возрастает в 1,49 раз при увеличении площади цитоплазмы в 1,63 раз (табл.2).

Указанные особенности свидетельствуют о гипертрофии кортикоцитов, площадь цитоплазмы которых возрастает в результате накопления органелл стероидогенеза. При морфометрии установлено также увеличение индекса Ind cyt/nucl в 1,57 раз по сравнению с данными контроля. Наряду с этим выявленное нами снижение числа липосом в кортикоцитах пучковой зоны может свидетельствовать об активации однонаправленного синтеза стероидных гормонов в кортикоцитах пучковой зоны. Учитывая тот факт, что явления гипертрофии, увеличения кровотока в пучковой зоне наблюдаются под влиянием кортикотропина (АКТГ) и митогенов [9], можно предположить, что в составе КСМЖ находятся вещества, обладающие указанными свойствами.

Сетчатая зона у неполовозрелых крыс довольно широкая и отделяется тонкой соединительнотканной прослойкой от мозгового вещества. Небольшие полигональной формы кортикоциты зоны формируют перекрещивающиеся тяжи, между которыми находятся капилляры в тонких прослойках соединительной ткани. Ядра кортикоцитов округлые, довольно крупные, содержат крупные ядрышки. В цитоплазме выявляются многогочисленные небольшие округлые митохондрии с везикулярными кристами. Липосомы одиночны, мелкие, расположены по всей цитоплазме. Между митохондриями находятся везикулы АЭПС, полирибосомы, диктиосомы комплекса Гольджи. Вблизи мозгового вещества встречаются одиночные дистрофически измененные клетки паренхимы.

Введение КСМЖ приводит к увеличению размеров кортикоцитов сетчатой зоны, расширению гемокапиляров между тяжами клеток паренхимы, умеренному разволокнению и утолщению прослоек соединительной ткани. Основная часть кортикоцитов имеют довольно хорошо сохранные ультраструктуры, особенно темные клетки. Цитоплазма их содержит множество митохондрий, диктиосомы комплекса Гольджи, везикулы АЭПС, единичные липосомы, встречаются и одиночные деструктированные кортикоциты.

Увеличение размеров кортикоцитов сетчатой зоны (в 1,55 раз) при уменьшении толщины этой зоны может свидетельствовать о развитии гипертрофии кортикоцитов, сопровождающейся ускоренной возрастной деградации сетчатой зоны под влиянием компонентов, входящих в состав СМЖ [8]. Сочетанное нарастание площади поперечного сечения кортикоцитов в сетчатой зоне при относительном уменьшении размеров ядер клеток и увеличении Ind cyt/nucl (в 1,82 раза), вероятно, отражает незавершенную функциональную активацию стероидогенеза в кортикоцитах сетчатой зоны (табл.2).

Таблица 2.

Морфометрия кортикоцитов различных зон коркового вещества надпочечников

Серия	К7-II			Э7-II
Зона коры	клубочковая	пучковая	сетчатая	клубочковая	пучковая	сетчатая
Площадь поперечного сечения кортикоцитов, мкм^2	37,76± 4,35	77,88± 3,84	60,90± 3,05	32,18± 3,16*	116,04± 7,14*	94,39± 5,94*
Площадь поперечного сечения ядра, мкм^2	10,77± 1,15	18,56± 1,63	17,96± 2,15	8,13± 1,09*	19,35± 2,38	17,64± 2,74
Площадь поперечного сечения цитоплазмы, мкм^2	26,99± 1,32	59,32± 2,97	42,93± 2,32	24,05± 3,45	96,69± 5,18*	76,75± 5,85*
Ind cyt/nucl	2,51	3,20	2,39	3,21	5,00	4,35

*р≤0,05

Выводы.

Введение спинномозговой жидкости лактирующих коров неполовозрелым крысам вызывает разнонаправленные изменения в функционально различных зонах коркового вещества надпочечных желез:

1. В клубочковой зоне уменьшение ее толщины сопровождается нарушением морфогенеза, развитием морфологических признаков угнетения функциональной активности эндокриноцитов (уменьшение размеров клеток и особенно их ядер, пикноморфность кариоплазмы, снижение числа и размеров ядрышек, содержания органелл стероидогенеза в цитоплазме).

2. В пучковой зоне значительное увеличение толщины зоны сочетается с гипертрофией кортикоцитов, нарастанием площади сосудистого русла, что свидетельствует о функциональной активации эндокриноцитов пучковой зоны.

3. Ускоренное завершение созревания сетчатой зоны сопровождается уменьшением ее толщины наряду с явлениями гипертрофии кортикоцитов.

Полученные в ходе работы результаты позволят выявить динамику и направленность изменений биометрических показателей и морфологических сдвигов под влиянием введения КСМЖ в функционально различных зонах коркового вещества надпочечных желез, а также явятся морфологическим обоснованием для разработки методов применения КСМЖ.

Рисунки и подписи к ним:

2 1

М

Г

Р

В

Рис. 1. Ультраструктура кортикоцита клубочковой зоны коры надпочечников неполовозрелых контрольных животных. В ядре (Я) доминирует эухроматин. Центрально расположенное крупное ядрышко имеет вид «тутовой» ягоды (1). Второе ядрышко прилежит к кариолемме (2). В цитоплазме множество митохондрий (М), полирибосом (Р), АЭПС в виде мелких везикул (В), липосомы одиночны, диктиосомы комплекса Гольджи (Г) чаще выявляются вблизи ядра. Увеличение 8200.

2

1

Рис.2. Фрагмент клубочковой зоны (1)и верхней части пучковой зоны (2) коркового вещества надпочечных желез неполовозрелых крыс после 3-кратного введения СМЖ. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х40.

1

Рис. 3. Ультраструктура кортикоцитов пучковой зоны у неполовозрелых крыс после 3-кратного введения СМЖ.. Умеренный отек и утолщение соединительнотканных перегородок. Расширение гемокапилляров, отек эндотелиоцитов (1). Деструкция крист митохондрий, мелкая вакуолизация цитоплазмы кортикоцитов. Увеличение 3200.

Литература:

1. Макаров А.Ю. Роль ликвора в нейрогуморальной регуляции физиологических функций.// Успехи физиологических наук.-1978.- Т. 9, № 4.- С.82-96.

2. Ажипа Я.И. Влияние цереброспинальной жидкости различного видового происхождения на трофическое и функциональное состояние органов и тканей и функциональное состояние и физиологическая активность цереброспинальной жидкости при нарушении трофической функции нервной системы / Я.И. Ажипа, В. Топало // Физиология человека. — 1986. — Т. 12, № 4. — С. 531–552.

3. Ткач В.В. Нормальный химический состав и содержание некоторых биологически активных веществ в цереброспинальной жидкости крупного рогатого скота / В.В. Ткач, В.В. Ткач(мл), В.В. Киселев //Клінічна анатомія та оперативна хірургія.- 2004.- №3.- С.61.

4. Ткач В.В. Определение тератогенных и эмбриотоксических свойств биопрепарата “Ликворин” / В.В. Ткач, А.В. Кубышкин, В.В. Ткач (мл.) //Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения: сб. тр. Крым. мед. ун-та. — Симферополь, 1998. — Т. 134. — С. 89–95.

5. Ликвор как гуморальная среда организма./ В.С. Пикалюк, Е.Ю. Бессалова, В.В. Ткач, и др. // ИТ «Ариал».- Симферополь, 2010.- 192 с.

6. Патент 62850А, Україна. Спосіб одержання цільного лікворного препарату: Патент 62850А, Україна, 7А61К35/24,А61К35/12. В.В. Ткач, Ф.В. Адамень, В.В.Лисенко и др. Опубл. 15.12.2003, Бюл.№12.- 3 с.

7. Саркисов Д.С., Пальцын А.А., Втюрин Б.В. Электронномикроскопическая радиоавтография клетки/ АМН СССР.- М.:Медицина,- 1980.- 264 с.

8. Каширина Н.К. Гисторадиоавтографическое исследование синтеза РНК в надпочечниках при хронической гипертермии //Вісник морфології.-1996.-2.1.-с.18-21.

9. Tepperman J., Tepperman H. Metabolic and endocrine physiology an introductory text.-Chicago&London.- 1989.-652 p.