Биологические науки / 6 Микробиология

Черногор Н.П., Жерносекова И.В., Тымчук А.А.,

Шрамко И.Ю., Винников А.И.

Днепропетровский национальный университет

Разработка питательной среды для культивирования  молочнокислых бактерий

Питательные среды, применяющиеся для культивирования молочнокислых бактерий сложные и  не всегда доступные. Несмотря на большое количество публикаций, посвященных питательным средам для культивирования молочнокислых бактерий, поиск  новых и оптимизация уже известных сред остается актуальным в настоящее время.

Известно, что оптимальный состав среды может быть определен двумя способами: методом эмпирического подбора и с использованием математических методов планирования экспериментов. Первый способ был до недавнего времени широко распространен в микробиологических исследованиях. Знание физиологических особенностей микроорганизмов позволяло биологам методом подбора и изменения какого-либо из факторов на неизменном фоне остальных компонентов подобрать хорошую и продуктивную питательную среду, но такой способ очень длителен. Более прогрессивным в биологических исследованиях является использование математических методов планирования экспериментов, которые позволяют значительно быстрее найти и обосновать оптимальный состав питательной среды. Большинство математических методов планирования экспериментов имеет целью получение математической модели процесса. Обработка экспериментальных данных ведется в четкой последовательности вычислительных операций. Статистический анализ значимости коэффициентов, полученного уравнения и его адекватности исследуемому процессу, в изучаемом диапазоне изменения параметров процесса, позволяет с достаточной уверенностью находить оптимальный состав среды и оптимальные условия культивирования по полученной математической модели процесса.

Объектом наших исследований служили молочнокислые бактерии рода L.acidophilus, выделенные из непастеризованного молока и молочнокислых продуктов. С целью разработки новой доступной и эффективной питательной среды для их культивирования и замены дорогостоящей коммерческой среды МRS, нами было проведено сравнительное изучение эффективности применения различных питательных сред (молочная, пептонная, гидролизованное молоко, сусло-агар, МПА с глюкозой, капустный и картофельный отвары и др.). Контролем служила питательная среда МRS. Культуру L. acidophilus, высевали на вышеуказанные среды и выращивали без аэрации при 37°С в течение 3 суток. Об эффективности использования вышеуказанных сред судили по накоплению биомассы исследуемой культуры L.acidophilus, которую определяли оптическим методом на КФК-2МП при λ 590 нм и методом прямого подсчета в камере Горяева, по активности кислотообразования и протеолитической активности.

Оптимизацию наиболее эффективной из исследованных опытных сред (азотной) проводили методом математического планирования эксперимента, согласно которому были составлены матрицы для семи сред.

Для реализации плана эксперимента производили посев суспензии используемой культуры L. acidophilus, на базовую (дрожжевой автолизат – 1; глюкоза – 1; КН2РО4 – 0,05; КН2РО4 – 0,05, в %) и вновь рассчитанные 7 вариантов опытных сред.

Проведение первой серии опытов позволило выявить вариант среды, который дал самый плохой результат. Из таблицы видно, что на исходной среде количество биомассы достигало 2,62·109 кл/мл, активность кислотообразования 110,0 Т°, а протеолитическая активность составляла 46,0 мг %, однако самый плохой результат был получен на среде №7 где изучаемые параметры составили 2,16·109 кл/мл, 68,0 Т°, 23,2 мг %, что значительно хуже, чем на других опытных вариантах азотной среды. Исходя из полученных данных, согласно симплексному методу был рассчитан и исследован новый вариант среды №7, состав которой отличался повышенным содержанием ионов (NН4)2SО4 в 6,5 раз и дрожжевого автолизата в 61 раз.

Таблица ‑ Показатели эффективности использования контрольной и опытных азотных сред для выращивания L. acidophilus.

 

№ среды

Количество посевного мате-риала (кл/мл)

Биомасса, кл/мл·109

Кислотность, после 24 час. культи-вирования, Т°

Протеолити-ческая актив-ность, мг %

Контроль- исходная среда

2 · 103

2,62 ± 0,1

110,0

46,0

среда №1

2 ·103

2,86 ± 0,2

95,0

44,9

среда №2

2 · 103

2,62 ± 0,3

86,0

38,0

среда №3

2 · 103

2,64 ± 0,4

90,2

40,0

среда №4

2 · 103

2,69 ± 0,2

100,7

43,7

среда№5

2 ·103

3,73 ± 0,2

103,0

44,2

среда№6

2 · 103

3,73 ± 0,2

165,3

47,3

среда№7

2 · 103

2,16 ± 0,1

68,0

23,2

новая среда№7

2 · 103

3,09 ± 0,1

99,0

40,9

 

Как видно из таблицы на новом варианте среды №7 не удается достичь более высоких показателей роста культуры так, как самой большой продуктивностью обладает среда №6 (3,73·109 кл/м, 165 Т° и 47,3 мг % соответственно).

Обобщая полученные результаты, можно отметить, что применение симплексного метода планирования эксперимента позволило нам  уже после первой ступени оптимизации при минимальных затратах времени и материалов оптимизировать соотношение 6 компонентов питания, которые входят в состав исходной азотной среды для культивирования лактобактерий, и получить среду сходную по питательной ценности с коммерческой средой МRS.