Кухар Е.В.

Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина,

г. Астана, Республика Казахстан

получение и характеристика моноклональных

антител, синтезированных к антигенам гриба

Trichophyton verrucosum

Дерматомицеты со всем основанием можно отнести к группе грибов-космополитов, встречающихся во всех уголках земного шара. Они поражают все виды домашних и большинство диких животных, встречаются у рыб и птиц. Многие виды дерматомицетов патогенны и для человека.

Методы индикации, используемые в настоящий момент для обнаружения возбудителя дерматомикозов в объектах внешней среды, имеют такие недостатки как длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность, сложность идентификации. В связи с этим перед современной микологией остро стоит вопрос о совершенствовании существующих и разработке новых методов диагностики дерматомикозов и индикации возбудителя болезни в объектах внешней среды, важным инструментом которых являются моноклональные антитела (МКА).

ИФА, с момента его внедрения в практику (Engvall E., 1971), широко используется с применением поликлональных сывороток, которые не всегда обеспечивают достаточную специфичность, чувствительность и воспроизводимость проводимых анализов [1]. Поэтому с целью получения высокоспецифичной ИФА тест-системы, получают специфические для возбудителя антитела – иммуноглобулины, направленные против уникальных эпитопов патогенов, характеризующихся постоянными свойствами, т.е. продуцируемых одним определенным клоном, или имеющих моноклональное происхождение и доступных в неограниченном количестве [2, 3]. В последнее время проводятся исследования по разработке современных методов диагностики дерматомикозов, позволяющие с высокой точностью дифференцировать возбудителей дерматомикозов. Так, ELISA, разработанная P. Zrimšek et all. /1999/ к антигенам T. mentagrophytes у иммунизированных кроликов имеет прогнозирующую ценность положительного и отрицательного теста 96 и 94%, соответственно [4].

Целью настоящей работы являлось изучение иммунохимических свойств МКА, синтезируемых штаммами гибридом, полученными к различным антигенам клеточной стенки Trichophyton verrucosum.

Материалы и методы. В работе использовали референтный штамм гриба дерматофита T. verrucosum var. verrucosum (далее T. verrucosum); белые мыши беспородные и линии BALB/c.

В качестве антигена для иммунизации мышей линии BALB/c использовали полисахаридный комплекс T. verrucosum, выделенный из мицелия методом O. Westphal, K. Jann (1967), и белковый антиген, полученный методом L.Tabatabai et al. (1979). Сырую мицелиальную массу дерматомицета получали глубинным культивированием при 28 С° в течение 15 суток. Концентрацию белка в полученном антигене определяли по методу M. Bradford (1976), концентрацию углеводов – серно-фенольным методом [5].

Для получения штаммов гибридом, использовались лимфоциты мышей линии BALB/c, иммунизированных этими антигенами, и миеломные клетки линии X63/Ag 8.6.5.3. Иммунизацию белых мышей проводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/мл в течение двух недель. Спустя три дня после последней иммунизации определяли титры антител в сыворотке крови мышей против введенного антигена [3].

Гибридизацию клеток миеломы Р3X63Ag8.653 со спленоцитами иммунных мышей проводили по методу V. Oi et L. Herzenberg (1980) [6]. Клонирование гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений (J. Goding et al., 1983) [7]. Активность и специфичность МКА, продуцируемых гибридомами в культуральную среду, определяли в непрямом ИФА [8].

Класс и подкласс моноклональных антител определяли с помощью двойной иммунодиффузии по методу O. Ouchterlony (1958). Константу связывания моноклональных антител устанавливали по методу J. Beatty et al [3].

Результаты исследований

В результате проведенной ранее работы из мицелиальной массы дерматомицета T. verrucosum были получены белковый и полисахаридный антигены с концентрацией белка 0,25±0,05 мг/мл и углеводов 0,750±0,52 мг/мл. В дальнейшем данные антигены были использованы для иммунизации мышей линии BALB/c с целью получения иммунных лимфоцитов и использования их для гибридизации с миеломными клетками. Выбранная схема иммунизации обеспечила достаточный уровень выработки специфических антител против дерматомицетов (таблица 1).

Таблица 1 – Титры антител иммунных мышей в непрямом варианте ИФА

Антиген	Титры специфических антител у мышей
	первая группа	вторая группа	контрольная группа
Белковый	1:800	1:1600	-
Полисахаридный	1:1600	1:12800	-

На следующем этапе был проведен ряд слияний иммунных спленоцитов мышей линии BALB/c c миеломными клетками. Для слияния использовали животных с наиболее высокими титрами антител в ИФА (не менее 1:800).

Слияние клеток селезенки мышей осуществляли с миеломными клетками линии Р3X63Ag8.653. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля-4000. Для культивирования клеточных культур использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 0,05 мг/мл пирувата натрия, 0,003 мл/л 2-меркаптоэтанола. Всего проведено по три гибридизации, результаты которых представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты гибридизации миеломных клеток со спленоцитами мышей, иммунизированных антигенами T. verrucosum

Антиген		Белковый			Полисахаридный
№ гибридизации		1	2	3	1		2	3
Количество засеянных лунок		384	384	384	384		384	384
Соотношение миеломных клеток и спленоцитов		1:4	1:3	1:8,5	1:4		1:4	1:5
Образование клонов	Кол-во	-	5	128	32		38	42
	%	-	1,3	33,3	8,3		9,9	10,9
Выход положительных клонов	Кол-во	-	-	5,4		-	-	0,3
	%	-	-	4		-	-	1
Титры МКА в культуральной жидкости		-	-	1:6400	-		-	1:3200

Полученные гибридные клетки, синтезируемые клонами гибридом, с целью получения асцитной жидкости вводили в концентрации 2·10 внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, которым предварительно, за 14 дней до введения гибридомы, был инъецирован пристан – 2,6,10,14-тетраметилпентадекан («Sigma», США) в дозе 0,5 мл на голову.

Очистку моноклональных антител из асцитной жидкости осуществляли методом высаливания сульфатом аммония до 50% насыщения. Осадок антител ресуспендировали в минимальном объеме ЗФР с рН 7,2 и диализовали против ЗФР в течение суток. Концентрация антител в асцитной жидкости, которую определяли по методу М. Бредфорда, составила 2-4 мг/мл. Очищенные моноклональные антитела в виде асцитной жидкости хранили при 70 °С без консервантов или при 4 °С с добавлением 0,1% азида натрия.

Субкласс моноклональных антител определяли в реакции диффузионной преципитации с моноспецифическими антисыворотками («Sigma»). В результате было определено, что синтезируемые гибридомами моноклональные антитела к белковому антигену дерматомицета T. verrucosum принадлежат к иммуноглобулинам класса М, а МКА, полученные к полисахаридному антигену гриба – к иммуноглобулинам класса G.

Константу связывания моноклональных антител определяли непрямым вариантом иммуноферментного анализа. Показатель константы связывания моноклональных антител составил 5·10⁷, что свидетельствует о высокой степени совпадения конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты.

В дальнейших исследованиях проводился контроль активности полученных МКА в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами во всех случаях активно взаимодействуют со специфичным антигеном гриба T. verrucosum и дают показания титров антител: белковый антиген – до 1:6400, полисахаридный – 1:3200.

Выводы

Таким образом, в результате проведенной работы нами получены моноклональные антитела к белковому и полисахаридному антигенам гриба T. verrucosum. Установлено, что полученные МКА характеризуются показателем константы связывания моноклональных антител равным 5·10⁷ М и показанием титров антител в непрямом варианте ИФА до 1:6400.

Использованная литература

1. Engvall E. and Perlman P. Enzyme Linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. 1971. – V. 8 – P. 871-874.

2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.Ф. и др. Клеточная инженерия. Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Биотехнология. В 8-ми кн. Книга 3. – М.: «Высшая школа», 1987, С. 127-167.

3. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток. Л.; Наука. 1987. – С.194-205.

4. P. Zrimšek, J. Kos, L. Pinter and M. Drobnič-Košorok. Detection by ELISA of the humoral immune response in rabbits naturally infected with Trichophyton mentagrophytes // Veterinary Microbiology. Vol. 70, Is. 1-2 , 1999, P. 77-86.

5. Кухар Е.В. Технология получения антигенов гриба Trichophyton verrucosum var. verrucosum // Вестник науки КазГАТУ им. С.Сейфуллина. №4 (47). Астана. КазГАТУ им. С.Сейфуллина. 2007 г. С. 107-112.

6. Oi V., Herzenberg L. Immunoglobulin – producing hybrid cell lines // Selected methods in cellular immunology // Ed. By. Mishell B and Shiigi. – San Francisco, 1980. - P. 351-352.

7. Goding J. Antibody production by hybridoma // J. Immunol. Meth. – 1980. - Vol. 39, № 1. - P. 285-308.

8. Кухар Е.В., Ескендирова С.З. Отработка параметров постановки иммуноферментного анализа для диагностики дерматомикозов // Материалы IV межд. науч.-практ. конф. молодых ученых «Современные тенденции развития аграрной науки в России», посвящ. 70-летию НГАУ. Новосибирск. 2006. С. 193-195.