Медицина / Экспериментальная и клиническая фармакология.

к.м.н. Дзугкоев С.Г., д.м.н. Дзугкоева Ф.С., Можаева И.В.

Учреждение Российской Академии Наук Институт биомедицинских исследований ВНЦ РАН и правительства РСО-Алания

Влияние убихинон-Q10 и афобазола на показатели окислительного стресса и гемодинамических нарушений при экспериментальном сахарном диабете.

Патогенетической основой формирования сосудистых осложнений при сахарном диабете (СД) является развитие эндотелиальной дисфункции. Открытие роли эндотелия в регуляции сосудистого тонуса и понимание механизма нарушений при патологии, в частности СД, позволяет полагать, что эндотелий становится прямой мишенью для повреждения. Ведущее значение в формировании дисфункции эндотелия придается действию гипергликемии, с которым связаны неферментативное гликозилирование белков, полиоловый путь метаболизма глюкозы и способность гипергликемии индуцировать свободно-радикальное окисление (СРО) в печени, сердечной мышце, почках. В условиях окислительного стресса нарушение функции эндотелия может быть обусловлено либо сниженной продукцией эндотелиальными клетками (эк) оксида азота NO, либо нарушением его биодоступности – как важнейшего вазодилатирующего фактора. В свою очередь, сниженная продукция NO может быть связана с низкой экспрессией фермента эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), с его пониженной активностью или ускоренным распадом NO. Образующийся при этом пероксинитрит оказывается повреждающим фактором. Считается, что окислительное повреждение митохондрий в клетке, лежит в основе различных патологий и антиоксиданты (АО), действующие избирательно на митохондрии, могут оказывать корригирующий эффект. Поэтому весьма актуальным является исследование показателей активности ПОЛ, антиокислительной системы (АОС) в крови, а также разработка возможного пути коррекции нарушений с применением митохондриально ориентированного антиоксиданта – убихинон-Q₁₀ при экспериментальном сахарном диабете и анксиолитика – афобазола. Поэтому целью исследования было изучение показателей окислительного стресса и содержания стабильных метаболитов оксида азота (NO), уровень экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), а так же характер микроциркуляторных изменений при экспериментальном сахарном диабете; обосновать и разработать патогенетически обоснованную корригирующую терапию. Опыты проведены на 105 крысах-самцах линии Вистар одной возрастной группы (10-14 мес.), массой 220-250 г. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977г), а также принципам Хельсинкской декларации (2000г). Контрольную группу составили интактные животные (n=20, по возрасту и массе сопоставимые с основной группой). Аллоксановый диабет моделировали введением 5% водного раствора аллоксана в дозе 15-18 мг/100 г. массы животного на фоне 24-48-часового голодания. Развитие диабета контролировали по уровню глюкозы крови, который определяли глюкозооксидазным методом, а концентрацию гликированного гемоглобина определяли колориметрически, используя тест наборы фирмы «БиоХимМак». Модель считалась состоявшейся при повышении уровня глюкозы крови и диуреза более чем в 2 раза. Животных брали в опыт по окончании остротоксического периода действия аллоксана, т.е. спустя 14 дней с момента развития ЭСД. В качестве биологических объектов исследования использовали кровь, эритроциты, аорты. В опытах определяли: активность ПОЛ по концентрации МДА в эритроцитах методом Asakawa T., 1980; активность ферментов АОС: СОД (методом аутоокисления адреналина), каталазы и концентрацию церулоплазмина, cсодержание в плазме крови стабильных суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO^2- и NO^3-, или NO_Х) с помощью реактива Грисса, согласно модифицированного экспресс-метода (Метельская В.А. 2005); экспрессию eNOS в аорте методом Westen blot 1 ч. Сканированные полосы на пленке выражали в пикселях, результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы Х к интенсивности контрольной полосы ЭСД. Микрогемодинамику исследовали ультразвуковым допплерографом ММ-Д-Ф (Санкт-Петербург, Россия). В каждой точке локации определяли M (средняя скорость, см/с), S (систолическая скорость, см/с), D (диастолическая скорость, см/с), Pi (пульсовой индекс, см/с) GD (градиент давления, мм.рт.ст) и рассчитывали RI (реографический индекс, у.ед). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Еxcel 2003. Результаты представлены в виде среднего значения (Mean) и ошибки среднего (SEM). Статистическую достоверность различий между двумя группами животных проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Уровнем статистической значимости считали р<0,05.

При ЭСД у крыс на фоне развивающейся гипергликемии повышалось содержание гликированного гемоглобина (HbAlc) с 5,3±0,81% до 8,6±0,71% (р<0,001). В этих условиях данные показали статистически достоверное повышение концентрации МДА в мембранах эритроцитов, что свидетельствует о развитии окислительного стресса. Одновременно происходило снижение активности ферментов АОС: СОД в эритроцитах и сыворотке крови, а также возрастание активности каталазы, и концентрации церулоплазмина в сыворотке крови. В этих условиях у крыс с СД концентрация суммарных метаболитов NO в сыворотке крови оказалась более низкой, чем у контрольных животных. Анализ гемодинамических изменений продемонстрировал повышение сосудистого тонуса и нарушения микроциркуляции. Реографические показатели, характеризуются более высокими значениями индекса Гослинга, повышением плотности сосудистой стенки (PI) и снижением градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело (RI), который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), у животных с ЭСД был достоверно выше, чем в контроле. Анализ перфузии тканей при ЭСД показал во всех точках локации снижение средней скорости кровотока (М) преимущественно за счет снижения систолической скорости кровотока (S), при повышении диастолической скорости кровотока (D). Снижение M и S кровотока в сосудах микроциркуляторного русла отражает уменьшение скорости тканевого обмена (перфузии) и развивается уже впервые месяцы течения СД. В соответствии с нашими данными повышение РI и RI сопровождается уменьшением продукции NO, о чем свидетельствует понижение содержания суммарных метаболитов NO в крови при ЭСД. Для коррекции выявленных нарушений в 3 и 4 группах экспериментальных животных вводили соответственно убихинон-коэнзим Q₁₀ и афобазол. Результаты, представленные на слайде, свидетельствуют о существенном снижении концентрации МДА в крови на фоне лечения в 3 и 4 группах животных. При сравнительном анализе результатов ингибирования ПОЛ наиболее эффективным оказался препарат, содержащий Q₁₀. Анализ активности АОС показал, что достоверно возросла активность СОД в плазме крови и эритроцитах, а повышенные данные каталазы и церулоплазмина достоверно снизились, хотя активность каталазы по сравнению с контролем осталась повышенной, как проявление клеточной компенсаторной реакции. Повышение активности СОД ингибирует накопление супероксидного анион-радикала, и тем самым способствует образованию Н₂О_2, разрушающаяся каталазой, с другой стороны, это препятствует образованию пероксинитрита, который повреждает эндотелий сосудов. На фоне лечения в 2-х группах экспериментальных крыс с сахарным диабетом статистически достоверно повысилась концентрация оксида азота в сыворотке крови. При сравнивании результатов, обнаружилось, что наиболее высокая концентрация NO, достигшая исходных контрольных значений, произошла на фоне убихинона коэнзима Q₁₀, на 2-ом месте афобазол. Поскольку нарушенная продукция NO в условиях ЭСД могла быть связана с взаимодействием NO с супероксиданион-радикалом (О₂^-) с образованием пероксинитрита, причем О₂^- значительно активнее реагирует с NO, чем скорость реакции дисмутации (О₂-) СОД с образованием пероксида (Н₂О₂); и с низким уровнем экспрессии и активностью фермента еNOS и с нарушением биодоступности NO. Поэтому мы исследовали состояние фермента еNOS: уровень экспрессии и активность энзима у диабетических крыс на фоне лечения. Данные свидетельствуют о повышении уровня экспрессии фермента на фоне лечения во всех вариантах опытов. Сравнительный анализ результатов показал, что наибольшая активность выявлена на фоне лечения коэнзимом Q₁₀, мене значительно под влиянием афобазола.Изучаемые препараты положительно влияли на функциональную активность сосудистого эндотелия, о чем свидетельствует повышение концентрации метаболитов NO в сыворотке крови животных с ЭСД, получавших лечение в течение месяца. Расслабление гладкомышечных элементов сосудов под действием NO реализуется через активацию растворимой гуанилатциклазы (ГЦ), повышение содержания цGMP, что в свою очередь приводит к снижению внутриклеточного содержания Ca²⁺. Коррекция дисфункции эндотелия на фоне лечения в 2-х группах исследованных животных с ЭСД сопровождалась улучшением микроциркуляторной гемодинамики, что проявлялось повышением средней и систолической скоростей кровотока, снижением упруго-эластических свойств сосудов микроциркуляторного русла (плотности сосудистой стенки РI) и периферического сосудистого сопротивления (индекса Пурсело RI). Эти гемодинамические изменения свидетельствуют о повышении процессов перфузии, обусловленное снижением сосудистого сопротивления и повышением средней и систолической скоростей кровотока. Для выяснения эффективности препаратов мы провели корреляционный анализ между концентрацией NO и скоростью кровотока соответственно средней, систолической и диастолической (r=+0,57; r=+0,61; r=+0,59; р<0,001). Данные показали сильную корреляционную связь между этими показателями. Т.о. комплексное исследование следующих показателей ПОЛ и АОС и концентрации NO и экспрессии NO-синтазы eNOS являются биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции, лежащей в основе сосудистых осложнений сахарного диабета типа 1. Коррекция сосудистых осложнений сахарного диабета и метаболизма NO на фоне лечения антиоксидантами убихинон коэнзимом Q₁₀ и афобазолом приводит к снижению интенсивности свободно радикального окисления в эритроцитах, повышению активности ферментов АОС, концентрации стабильных метаболитов оксида азота в крови, а также уровня экспрессии eNOS. Все эти метаболические позитивные изменения сопровождались улучшением гемодинамики в микроциркуляторном звене и повышению тканевой перфузии.