Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

получение препарата иммобилизованной бактериальной нуклеозидфосфотрансферазы

Нуклеозидфосфотрансфераза (ФК 2.7.1.77; НФТ) представляет собой фермент, катализирующий перенос низкоэнергетических фосфатных групп с молекул НМФ, п-нитрофенилфосфата (пНФФ), фенилфосфата и др. на гидроксил пентозного фрагмента нуклеозида [1–3]. Пример биотрансформации нуклеозида (аденозина) в НМФ, катализируемой НФТ, приведен на схеме.

Ранее мы сконструировали рекомбинантные штаммы E. coli NPT5 и E. coli НФТ-15, продуцирующие НФТ Erwinia herdicola, разработали методы выделения и очистки этого фермента и продемонстрировали возможность его использования для синтеза природных и модифицированных НМФ [4, 5].

Цель настоящей работы заключалась в получении катализатора, проявляющего нуклеозидфосфотрансферазную активность, для многократного использования при синтезе НМФ.

Материалы и методы. Конструирование и культивирование рекомбинантных штаммов E. coli, продуцирующих НФТ Erwinia herdicola, а также выделение и очистка этого фермента описаны нами ранее [4, 5].

Нуклеозидфосфотрансферазную активность определяли по скорости синтеза АМФ из аденозина при использовании в качестве донора фосфата пНФФ. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обеспечивало образование АМФ в количестве 1 нмоль за 1 мин.

Иммобилизацию проводили на активированный последовательно 3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропил-триметоксисиланом и глутаровым альдегидом SiO₂ [6] (далее активированный силикагель). К 1 г активированного силикагеля приливали 20 мл раствора фермента (900 000 ед. активности) в 0,1 М Na-ацетатном или К-фофатном буфере (КФБ), инкубировали 3 ч при комнатной температуре. После декантирования раствора носитель промывали 4 раза по 100 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера (рН 4,5). Осадок высушивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре в течение 12 ч.

Синтез АМФ иммобилизованной НФТ проводили, инкубируя смесь (2 мл), содержащую 30 мМ аденозин, 60 мМ пНФФ, 0,2 М Na-ацетатный буфер (рН 4,5) и ферментный препарат (40 ед.), 5 ч при 45^oC.

Результаты и обсуждение. Нами в качестве метода иммобилизации была выбрана ковалентная пришивка фермента с помощью глутарового альдегида на предварительно активированный 3-[2-(2-аминоэтил-амино)этиламино]пропил-триметоксисиланом силикагель.

3-[2-(2-аминоэтиламино)этиламино]пропил-триметоксисилан – соединение, дающее при конденсации на силикагеле с помощтю “sol-gel”-метода аминированную поверхность. Глутаровый альдегид; наиболее широко используемый сшивающий агент для ковалентной иммобилизации ферментов. Применение данного реагента основано на образовании в слабощелочной среде азометиновой связи оснований Шиффа (-СН=N-) в реакции альдегида с аминогруппами носителя. Вторая альдегидная группа образует такое же основание со свободными аминогруппами в пришиваемом белке.

На первом этапе нами была изучена эффективность иммобилизации НФТ от рН среды. В качестве буферов использовали 20 мМ Na-ацетатный буфер (рН 4–6), и 20 мМ КФБ (рН 6–8). Результаты представлены в таблице.

Таблица

Влияние рН на иммобилизацию НФТ

рН	Белок, связавшийся с матрицей, % от исходного количества	Активность НФТ, % от исходного количества	Активность иммобилизованной НФТ, ед/мг препарата
4	70	23	173
4,5	80	27	198
5	75	25	183
5,5	60	18	132
6	45	11	81
7	30	5	37

Как видно из представленных данных, наиболее эффективно иммобили-зация НФТ проходит при рН 4,5 (присоединяется к матрице 80% белка с сохра-нением 27% исходной активности). На следующем этапе работы были изучена операционная стабильность иммобилизованного фермента.

Для исследования стабильности НФТ проводили реакцию синтеза АМФ из аденозина и пНФФ. По окончании синтеза биокатализатор отбирали центрифугированием и вносили в новую реакционную смесь. Результаты этого эксперимента представлены на рисунке.

Рисунок – Операционная стабильность иммобилизованной НФТ

А – активность препарата в % от исходной

Как видно из рисунка, иммобилизованная НФТ сохраняет до 90% своей активности при использовании в течение 8 циклов. Далее, активность начинает снижаться до 60% к 14 циклу использования.

Для исследования стабильности препарата иммобилизованной НФТ при хранении его ресуспендировали в 50 мМ Трис–HCl-буфере (pH 7,0), содержащем 10% глицерина, и помещали на холод (+4°С). В описанных экспериментальных условиях полученный ферментный препарат сохраняет свою активность при хранении в течение минимум 2 мес.

Литература:

1. Humble, R.W. Phosphorylation of some 5-aminoimidazole nucleosides to the 5'-phosphates using a phosphotransferase from wheat / R.W. Humble, G. Mackenzie, G. Shaw // Nucleosides, Nucleotides.– 1984.– Vol. 3, № 4.– Р. 363–367.

2. Rutkowski, M. Phosphorylation of acyclonucleosides by nucleoside phosphotransferase from higher plants and bacteria / M. Rutkowski, M. Draminski // Acta Biochim. Pol.– 1991.– Vol. 38, № 4.– P. 449–457.

3. Chemical-enzymatic synthesis of 3'-amino-2',3'-dideoxy-b-D-ribofurano-sides of natural heterocyclic bases and their 5'-monophosphates / G.V. Zaitseva [et al.] // Collect. Chech. Chem. Commun. – 1993. – Vol. 58. – P. 60–63.

4. Use of Erwinia herbicola recombinant nucleoside phosphotransferase for the synthesis of pharmaceutically useful nucleoside-5′-monophosphates / S.V. Kvach [et al.] // New Aspects of Biotechnology and Medicine / Eds. A.M.Egorov and G.E.Zaikov. – NY: Nova Science Publishers, Inc. – 2007. – P. 7–13.

5. Штамм бактерии Escherichia coli, продуцирующий нуклеозидфосфотрансферазу Erwinia herdicola: пат. 11916 Респ. Беларусь / С.В. Квач, Л.А. Ерошевская, А.И. Зинченко; заявл. 01.10.07; опубл. 30.06.09.

6. Guisan, J.M. Immobilization of Enzymes and Cells / J.M. Guisan. – 2-nd ed. – Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., 2006. –449 p.