Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск

Синтез Диаденозин-5¢,5¢¢¢-P¹,P⁴-тетрафосфата с использованием Иммобилизованной

лизил-трнк-синтетазы

Диаденозин-5¢,5¢¢¢-P¹,P⁴-тетрафосфат (Ар₄А) имеет важное фармакологическое значение и может стать субстанцией лекарственных препаратов для терапии ряда заболеваний человека [1, 2]. Молекула Ар₄А содержит два аденозиновых остатка, соединенных тетрафосфатным мостиком (рис. 1).

Рисунок 1. Структурная формула Ар₄А

Для синтеза Ар₄А предложены многостадийные и трудоемкие химические процессы [3]. С другой стороны известно, что синтез вышеуказанной молекулы из АТФ может осуществляться с помощью бактериальных аминоацил-тРНК-синтетаз.

Ранее нами была получена рекомбинантная лизил-тРНК-синтетаза Escherichia coli (LysUHis), имеющая на N-конце остаток из шести гистидинов, необходимых для аффинной очистки белка [4]. В настоящей работе показано, что такая модификация белковой молекулы может быть использована для иммобилизации LysUHis на аффинную смолу Ni-NTA (Qiagen, США). Полученный иммобилизованный препарат LysUHis обладает повышенной операционной стабильностью (выдерживает 10 технологических циклов) и может использоваться для синтеза Ар₄А.

Материалы и методы. В настоящей работе был использован рекомбинантный штамм бактерий E. сoli LysU-12, продуцирующий гомологичную LysUHis [4]. Индукцию экспрессии рекомбинантного белка и его очистку с использованием металлоаффинной хроматографии проводили согласно работе [5]. Препарат LysUHis после хроматографии диализовали против 1000-кратного объема 20 мМ Трис-HCl-буфера (рН 7,5), содержащего 0,2 мМ ЭДТА и 10% глицерина. За единицу активности фермента LysUHis принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль Ap₄A за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Для иммобилизации фермента к 50 мл раствора, содержащего 100 мг очищенной LysUHis (суммарная активность 360 ед.), добавляли 20 мл смолы Ni-NTA. Суспензию выдерживали на холоду (+4^оС) в течение 2–3 ч, после чего её центрифугировали при 5000 g в течение 3 мин. Осадок промывали несколько раз 20 мМ Трис-HCl-буфером (рН 7,5). Полученный конъюгат смолы и фермента ресуспедировали в равном объеме 20 мМ Трис-HCl-буфера (рН 7,5). Суспензию иммобилизованного фермента (суммарная активность 180 ед.) хранили при +4^оС.

Для синтеза Ар₄А иммобилизованную LysUHis в количестве 8,4 ед. вносили в реакционную смесь (конечный объем 100,0 мл), содержащую (мМ): MgCl₂ – 10; ZnCl₂ – 0,16; буфер MOPS-КОН (рН 7,5) – 20; АТФ – 4,3; L-лизин – 2,4. После прибавления 100 ед. пирофосфатазы [6] смесь инкубировали при 42^оС в течение 2 ч. Затем реакционную смесь кипятили в течение 10 мин, центрифугировали 30 мин при 20000 g, отбирали супернатант и наносили его на хроматографическую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой DE-32 (Whatman, Англия). Ар₄А элюировали с использованием линейного градиента бикарбоната аммония (0,5 л, от 100 до 400 мМ). Элюат упаривали досуха на роторном испарителе при 55^оС. Осадок промывали охлажденным спиртом и высушивали под вакуумом.

Результаты и их обсуждение. Иммобилизация LysUHis. Выделенный фермент из биомассы бактерий штамма E. coli LysU-12 был иммобилизован на смолу Ni-NTA. В результате иммобилизации со смолой связалось 60% LysUHis. При этом, не смотря на то, что общая активность полученного препарата снизилась в 2 раза (180 ед.) по сравнению с раствором белка (360 ед.), иммобилизация на аффинную смолу LysUHis позволила многократно (до 10 раз) использовать его для синтеза Ар₄А (рис. 2). Следует особо подчеркнуть, что активность препарата иммобилизованной LysUHis остается неизменной в течение 1 года при хранении при -20^оС.

Рис. 2. Операционная стабильность препарата LysUHis,

иммобилизованной на Ni-NTA

Выделение Ap₄A. На следующем этапе работы был проведен ферментативный синтез Ap₄A. Использование двухстадийной хроматографии на колонке с ионообменной смолой DE32 позволило получить высокоочищенный продукт. В литературе описан способ получения данного вещества с применением препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии [7]. Однако использованный метод характеризуется сложностью и невозможностью отделения некоторых побочных продуктов реакции. Предложенный нами метод выделения Ap₄A является недорогостоящим, достаточно простым и позволяет достичь выхода изолированного продукта, превышающего 80%.

Заключение. Таким образом, нами был получен препарат иммобилизованной LysUHis E. сoli, с помощью полученного препарата фермента проведен препаративный синтез Ар₄А, выделен и очищен целевой динуклеотид.

Литература:

1. Grummt F. Diadenosine 5',5"'-P1,P4-tetraphosphate triggers initiation of in vitro DNA replication in baby hamster kidney cells / PNAS. – 1978. – Vol. 75, № 1. – Р. 371–375.

2. McLennan A.G. Dinucleoside polyphosphates—friend or foe? // Pharmacology & Therapeutics. – 2000. – Vol. 87, № 2/3. – Р. 73–89.

3. Reiss, J., Moffat J. Dismutation reactions of nucleoside polyphosphates. 3. The synthesis of alpha, omega-dinucleoside 5'-polyphosphates // J. Org. Chem. – 1965. – Vol. 30. – P. 3381–3387.

4. Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. Оптимизация условий экспрессии лизил-тРНК-синтетаз в генноинженерных штаммах Escherichia coli // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 2010. – № 1. – С. 65–69.

5. Novagen pET System Manual, 11^th edition / http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/Novagen_petsystem.pdf.

6. Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. Создание генно-инженерного штамма-суперпродуцента пирофосфатазы // Умение и нововъведения–2007: материали за 3-а междунар. науч.-практ. конф., София, 16–31 отомври 2007 г. – Т. 12. – С. 21–25.

7. Wright M., Boonyalai N., Tanner J.A., Hindley A.D., Miller A.D. The duality of LysU, a catalyst for both Ap4A and Ap3A formation // FEBS J. – 2006. – Vol. 273, № 15. – P. 3534–3544.