Биричевская Л.Л., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

 

выделение и очистка внеклеточной фосфолипазы D sTREPTOMYCES NETROPSIS

 

Как известно, фосфолипаза D (ФЛД) кроме основной гидролитической реакции способна осуществлять реакцию трансфосфатидилирования, заключающуюся в переносе фосфатидного остатка на первичную или, в особых условиях, на вторичную спиртовую группу соединений с образованием их фосфатидильных производных. Особенное значение имеет синтез коньюгатов фосфолипидов с противовирусными и противоопухолевыми нуклеозидами [1].

Ранее нами был отобран штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235 в качестве продуцента ФЛД [2] и изучена субстратная специфичность этого фермента в составе фильтрата культуральной жидкости (КЖ) в реакции синтеза конъюгатов различных нуклеозидов с фосфолипидами [3, 4]. Целью данной работы было создание препаратов ФЛД различной степени очистки.

Материалы и методы. Культивирование Streptomyces netropsis БИМ В-235 (далее Str. netropsis), хранящегося в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси, и определение активности ФЛД проводили, как описано нами ранее [3, 5]. Трансферазную активность ФЛД определяли в реакции переноса фосфатидильного остатка с фосфатидилхолина (лецитина) на 5′-гидроксильную группу тимидина. Количество образующегося 5′-фосфатидилтимидина определяли с помощью ТСХ на пластинах Silufol-UV254 в системе растворителей хлороформ–метанол–25%-ный аммиак (14:4:0,15 по объему). За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало трансформацию субстрата или образование продукта в количестве 1 нмоль за 1 мин.

         Определение молекулярной массы нативной ФЛД проводили методом гель-фильтрации на колонке с гелем Toyopearl HW-55F, уравновешенной 50 мМ Na-ацетатным буфером (рН 6,0), содержащим 0,15 М NaCl.

Результаты и обсуждение. Высокая активность изучаемой ФЛД в составе фильтрата КЖ, которая не уменьшается во время его хранения при +4°С не менее полугода, а также тот факт, что в нем не обнаружено интерферирующих ферментов, способных разрушать субстраты и продукты реакции трансфосфатидилирования нуклеозидов, позволило рассматривать непосредственно фильтрат КЖ в качестве одного из препаратов ФЛД (Фосфолипаза D-1). Несмотря на возможность непосредственного применения фильтрата КЖ Str. netropsis для синтеза фосфатидилнуклеозидов, сухой биокаталитический препарат имеет ряд преимуществ перед жидкой формой, в особенности при хранении.

Общая схема получения препаратов ФЛД различной степени очистки представлена на рис. 1.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1 Схема получения препаратов ФЛД

 

Для выделения ФЛД из фильтрата КЖ было реализовано два подхода. С целью получения удобного в применении сухого биокаталитического препарата разработан метод, включающий фракционирование белков фильтрата КЖ ацетоном (32–60 об.%) при 4°С и рН 5,8 в течение 0,5 ч, последующее высушивание под вакуумом и механическое измельчение осадка. Полученный ферментный препарат (Фосфолипаза D-2) высокостабилен (хранится при 4°С без потери активности не менее 2 лет) и пригоден для синтеза фосфолипидных производных нуклеозидов. Коэффициент очистки ФЛД составляет 3,2; выход по ферментативной активности – 87%.

Для получения высокоочищенной ФЛД был разработан простой и эффективный способ, в основе которого лежит его аффинная сорбция лецитином. При этом непосредственно в фильтрате КЖ суспендируется лецитин, после связывания фермента с субстратом осуществляется его осаждение центрифугированием, элюция с помощью натрий-ацетатного буфера (рН 5,6) с 1% тритона Х-100, диализ, осаждение этанолом и вакуум-сушка. После оптимизации таких параметров, как величина рН (5,2), концентрация лецитина (2,5 мг/мл) и время инкубации (1,5 ч), удается сорбировать на лецитин до 90% фермента. В целом, метод позволяет добиться очистки ФЛД в 105 раз с выходом 72%. Полученный препарат высокоочищенной ФЛД (Фосфолипаза D-3) использовали для исследования основных физико-химических свойств фермента.

Методами гель-фильтрации и гель-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что ФЛД Str. netropsis представляет собой несубъединичный белок с молекулярной массой 36–37 кДа. При изучении рН- и термостабильности ФЛД выявлено, что фермент нестабилен при инкубации в кислых растворах и проявляет устойчивость в интервале рН 5,5–8,0 и при температурах, не превышающих 55оС. Максимальную трансферазную активность в реакции синтеза фосфатидилнуклеозидов фермент проявляет при рН 6,0 и температуре 45оС (рис. 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рис. 2. Влияние температуры (А) и рН (Б) на активность (1)

и стабильность (2) ФЛД Str. netropsis

Литература:

         1. Alexander, R.L. Lipid nucleoside conjugates for the treatment of cancer / R.L. Alexander, G.L. Kucera // Carr. Pharm. Design. – 2005. – Vol. 11, № 9. – P. 1079–1089.

            2. Фещенко, Л.Л. Первичный отбор продуцентов микробной фосфолипазы D / Л.Л. Фещенко [и др.] // Микробиология и биотехнология на рубеже XXI столетия: материалы междунар. конф., Минск, 1–2 июня 2000 г. – C. 135–136.

          3. Субстратные требования фосфолипазы D из Streptomyces netropsis при синтезе фосфолипидов по реакции трансфосфатидилирования / Л.Л. Биричевская [и др.] // Химия природ. соединений. – 2006. – № 1. – С. 26–29.

          4. A comparison of enzymatic phosphorylation and phosphatidylation of β-L- and β-D-nucleosides / L.L. Birichevskaya [et al.] // Biotechnol. Lett. – 2007. – Vol. 29, № 2/3. – P. 585–591.

5. Биричевская, Л.Л. Влияние состава питательной среды и условий культивирования на продуцирование фосфолипазы D культурой Streptomyces netropsis БИМ В-235 / Л.Л. Биричевская, А.И. Зинченко // Научное пространство Европы-2007: материалы III международ. научно-практ. конф., Днепропетровск, 16–30 апреля 2007 г. – Т. 5. – С. 6–15.