Ветеринария /1

Якимчук Е.А., Анников В.В.

Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова

АНАЛИЗ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ДАННЫХ ТРАВМАТОЛОГИЧЕСКИ БОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КАФОРСЕНА

Иммунная система играет немаловажную роль в поддержании гомеостаза организма. Однако при определенных воздействиях факторов внешней и внутренней среды ее функциональная активность изменяется. Например, при переломах происходит ее угнетение вследствие нарушения приспособительных и защитных механизмов. Переломы, по данным некоторых авторов [7, 1], имеют в последние годы стойкую тенденцию к увеличению. Наиболее актуальна данная проблема для крупных городов. Исследования показывают, что переломы вызывают развитие так называемой травматической болезни [4]. Являясь системной, она вызывает ряд изменений в других системах организма. Именно иммунная система одной из первых реагирует на перелом и усиленно синтезирует и экскретирует из депо резервы фагирующих клеток (нейтрофилы, лимфоциты, NK-клетки) [3, 4].

Т-лимфоциты (хелперы и супрессоры) обладают способностью распознавать чужеродные клетки и клетки организма, несущие на своей поверхности SC-антиген [6]. Возможно, именно это позволяет лимфоцитам вызывать пролиферацию фибробластов и выделять лимфокины, специфичные для данной клеточного пула. Также известен факт коррекционного действия Т-лимфоцитов от здорового организма на процесс остеопетроза. Помимо этого, фагирующие клетки несут на своей клеточной мембране рецептор к паратиреоидному гормону, который, как известно, активизирует деятельность остеокластов, не имеющих к нему собственных рецепторов [8,9].

Было замечено, что введение травматически больным животным иммуностимулирующих препаратов ускоряет сроки консолидации и снижает процент появления нежелательных последствий: остеомиелит, псевдоартроз, воспалительные явления в месте перелома [5]. Однако применение таких препаратов длительное время нежелательно из-за негативного влияния на процесс образования иммунокомпетентных клеток и дальнейшее снижение данной функции самим организмом.

Препаратом выбора в нашем случае стал кафорсен. Это гомеопатический препарат. При его использовании костная ткань импрегнирует кальций и фосфор для восстановления анатомической целостности кости и ускоряет срок консолидации костных отломков [2].Однако влияние его на органы иммунопоэза в доступной литературе мы не обнаружили. Поэтому мы поставили перед собой цель: определить изменения в лимфатических узлах и селезенке травматически больных животных при использовании кафорсена.

Объектом исследований явились кролики породы белый венский. Животные были сформированы в две группы по 4 головы в каждой по принципу аналогов. Для проведения опыта был смоделирован флексионный перелом костей голени. На 3-и установлены аппараты внешней стержневой фиксации. Животным обеих групп проводили превентивную антибиотикотерапию и санацию остеофиксаторов перекисью водорода. Первой группе животных дополнительно вводили кафорсен в дозе 1мл внутримышечно в течение 10 дней.

На 30 сутки животных выводили из эксперимента и проводили взятие материала (подколенные лимфатические узлы с обеих конечностей и селезенку) для проведения гистологического исследования. Указанные органы помещали в 10% нейтральный водный раствор формалина. На замораживающем микротоме модели 2515 Reichert Wien готовили гистологические срезы толщиной 15 мкм. Приготовленные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы исследовали при различной степени увеличения (50, 100, 150 и 300 раз).

В своей работе мы использовали клинический, гематологический, гистологический и статистический методы исследований.

Клиническое обследование животных в первые сутки после операции не выявило каких-либо значимых различий в обеих группах. На травмированной конечности наблюдали отёк мягких тканей, гиперемию, болезненность при пальпации, незначительную экссудацию в месте контакта фиксатора с мягкими тканями. Однако уже к пятым суткам у животных опытной группы явлений экссудации обнаружено не было. У животных же контрольной группы таковая наблюдалась вплоть до четырнадцатых суток исследования.

Таблица

Динамика гематологических показателей кроликов в постоперационный период(n=4, M±m, Р≤0,05).

Показатели, ед. измерения	Норма	Первая группа				Вторая группа
		До начала опыта	3 сутки	14 сутки	30 сутки	До начала опыта	3 сутки	14 сутки	30 сутки
Er, ×10^12/л	3,9-8,1	5,4 ±0,6	3,7 ±0,4	4,2 ±0,4	5,9 ±0,8	4,6 ±0,5	3,7 ±0,2	3,9 ±0,1	4,4 ±0,6
L, ×10^9/л	5,9-9,0	5,5 ±1,2	7,4 ±1,4	6,4 ±1,0	5,9 ±0,7	5,8 ±0,9	6,8 ±0,4	6,7 ±1,2	6,0 ±0,9
Гематокрит,%	35-45	31,9 ±2,2	23,5 ±1,9	25,8 ±2,8	33,7 ±3,5	27,0 ±2,8	21,3 ±1,1	22,3 ±1,7	28,2 ±3,5
Гемоглобин, г/л	105-125	111,0 ±15,8	84,5 ±4,9	93,5 ±4,9	120,5±10,2	103,3±8,1	80,3 ±4,6	88,5 ±8,0	109,3±9,1
Эозинофилы, %	1-3	1,0 ±0,4	2,8 ±1,2	1,8 ±0,5	1,5 ±0,3	1,8 ±0,3	2,8 ±1,0	3,8 ±0,9	2,0 ±0,7
Ю, %	0	0,8 ±0,3	1,3 ±0,3	0,8 ±0,5	1,3 ±0,5	0,8 ±0,5	1,8 ±0,5	2,3 ±0,3	1,3 ±0,6
П, %	5-9	3,3 ±0,6	4,5 ±1,0	4,0 ±0,9	3,8 ±0,9	3,8 ±0,6	5,5 ±1,0	4,5 ±0,7	3,8 ±0,5
С, %	33-39	19,8 ±1,4	26,8 ±1,9	30,3 ±2,9	34,0 ±2,3	26,8 ±1,8	19,0 ±1,5	17,3 ±2,0	31,0 ±1,6
Моноциты, %	1-3	1,5 ±0,3	2,0 ±0,6	2,8 ±0,3	1,3 ±0,3	2,3 ±0,3	2,0 ±0,4	3,0 ±0,6	2,3 ±0,6
Лимфоциты, %	43-62	73,5 ±2,7	62,3 ±1,9	60,3 ±1,4	58,0 ±0,4	64,5 ±3,9	68,5 ±0,7	68,8 ±1,7	59,3 ±3,4
Базофилы, %	0-2	0,3±0,3	0,5 ±0,3	0,3 ±0,3	0,3 ±0,3	0,3 ±0,3	0,5 ±0,3	0,5 ±0,3	0,5 ±0,3

При проведении гематологических исследований были получены достоверные данные, представленные в таблице.

При анализе данных таблицы выявили следующее. Количество эритроцитов в первой и второй группах находилось в рамках физиологической нормы. На третьи сутки после операции их уровень снизился, особенно в первой группе (3,7±0,36×10¹²/л). Однако на протяжении последующих дней наблюдалось постепенное его увеличение, и к 30 суткам эксперимента был превышен исходный уровень (5,4±0,6×10¹²/л – до операции, 6,0±0,8×10¹²/л к 30-м суткам эксперимента). Во второй же группе содержание эритроцитов также имело положительную динамику, однако к 30 суткам оно не достигло исходного уровня (4,6±0,5×10¹²/л до операции, 4,4±0,6×10¹²/л к 30-м суткам эксперимента).

Уровень лейкоцитов изначально находился на низком уровне в обеих группах. Через 3-е суток после остеосинтеза количество лейкоцитов увеличилось и составило 7,4±1,4×10⁹/л в первой группе и 6,8±0,4×10⁹/л во второй. На всем протяжении постоперационного периода уровень данной клеточной популяции постепенно уменьшался и к 14-м суткам составил в первой 6,4±1,0×10⁹/л, во второй – 6,7±1,2×10⁹/л; к 30-м суткам – 5,9±0,7×10⁹/л и 6,0±0,9×10⁹/л соответственно. Следовательно, у животных первой группы восстановился прежний уровень лейкоцитов, в то время как у животных второй их уровень на 30-е сутки превышал исходный. Данное состояние может свидетельствовать о сохраняющихся у животных второй группы воспалительных явлениях. Уровень гематокрита у животных обеих групп на 3-и сутки после операции значительно снизился и составил 23,5±1,9% в первой и 27,1±2,8% во второй. Затем наблюдалась положительная динамика во всех группах. Однако у животных второй группы восстановление его исходного уровня шло медленнее и к 30-м суткам составило 28,2±3,5%. В то же время данный показатель у животных первой группы находился на уровне 33,7±3,5%. Динамика гемоглобина у животных первой группы свидетельствует о более активном насыщении кислородом эритроцитов и, как следствие, более лучшего насыщения им тканей. К концу эксперимента данный показатель превышал исходный на 8,5%, у животных же второй группы всего на 6%.

Эритропения и анемия в фазу срочной адаптации является стандартной реакцией организма на травму [2], что обусловлено спазмом сосудов для уменьшения кровопотери. Ранняя нормализация содержания эритроцитов и гемоглобина у кроликов первой группы была обусловлена, очевидно, вазодилятирующим действием кафорсена, а именно, фторидом кальция, входящего в его состав.

Уровень эозинофилов также был повышен на третьи сутки после остеосинтеза у животных обеих групп и содержание данных клеток заметно не отличалось от исходного: 1,5±0,3% в первой группе и 2,0±0,7% во второй группе. Колебания уровня палочкоядерных псевдоэозинофилов у животных первой и второй групп не носили ярко выраженной динамики и поэтому не представляют большой диагностической ценности. Количественный показатель сегментоядерных псевдоэозинофилов у животных второй группы снижался до 14-х суток (17,3±2,0%), к 30-м суткам наблюдалось его увеличение (31,0±1,6%). Это говорит об угнетении клеточного иммунитета животных данной группы на протяжении 14 суток после травмы. У животных первой группы аналогичный показатель на 14-е сутки составил 30,3±2,9%, на 30-е – 34,0±2,3%. Повышение абсолютного числа сегментоядерных псевдоэозинофилов у животных первой группы к 30-м суткам опыта (2,02×10⁹/л против 1,09×10⁹/л до начала эксперимента) произошло за счет выброса данной клеточной популяции из депо красного костного мозга. Необходимо отметить, что показатели этих клеток находились в пределах физиологической нормы.

Абсолютное количество моноцитов у животных первой группы до начала опыта составило 0,08×10⁹/л, а на 30-е сутки – 0,07×10⁹/л. Данная динамика говорит о том, что организм животных не нуждался в фагоцитирующей функции данных клеток. У животных же второй группы исходное количество находилось на уровне 0,13×10⁹/л, а к 30-м суткам составило 0,14×10⁹/л, что указывает о наличии незначительных очагов воспаления в месте перелома. Уровень лимфоцитов у животных первой группы изначально был выше нормы (73,5±2,7%). Однако по ходу исследования количество данной клеточной популяции снижалось, составив на 3-и сутки 62,3±1,9%, на 14-е - 60,3±1,4%, на 30-е - 58,0±0,4%. У животных второй группы наблюдалась следующая динамика этого показателя. Данная динамика происходит за счет вытеснения лимфоцитов сегментоядерными псевдоэозинофилами, что может расцениваться как физиологически обоснованный процесс при реакции организма на травму. До 14-х суток наблюдалось повышение количества лимфоцитов (68,8±1,7 %),к 30-м суткам их количество составило 59,3±3,4%.

Колебания содержания в периферической крови животных обеих групп базофилов были незначительные и не имеют в данном случае диагностической значимости.

При микроскопическом исследовании лимфатических узлов противоположной конечности выявили сохранение структуры органа, компактное расположение лимфоцитов, лимфатические фолликулы средних размеров, в единичных фолликулах умеренная макрофагальная реакция, незначительный отек стромы, умеренный отек паренхимы и синусов, гиперплазия лимфоидного вещества.

При гистологическом исследовании лимфатических узлов травмированной конечности животных контрольной группы было обнаружено следующее: тинкториальные свойства ткани не нарушены, лимфоидное вещество компактно размещено, хорошо заметны герминативные центры, лимфатические фолликулы средних размеров, наблюдался незначительный отек стромы органа, но выраженный в синусах, полнокровие, гиперплазия лимфоидного вещества.

При исследовании лимфатических узлов с левой не травмированной конечности обнаружили тонкую фиброзную капсулу, сохраненную гистологическую картину строения органа (выражены границы лимфатических фолликулов, присутствуют герминативные центры), лимфоидные фолликулы средних и мелких размеров со светлыми центрами, незначительный отек синусов.

Микроскопия гистосрезов лимфоузлов травмированной конечности животных опытной группы выявила тонкую фиброзную капсулу, не инфильтрованную окружающую жировую клетчатку, сохраненную гистокартину строения (четко выраженные лимфатические фолликулы и строма органа, наличие синусов), хорошо выраженные лимфатические фолликулы с наличием в них герминативных центров, незначительный отек стромы органа.

Гистологически селезенка животных контрольной группы выглядела следующим образом: фиброзная капсула местами утолщена, отмечалось компактное расположение лимфоидной ткани, красная пульпа умеренно кровенаполнена, отек стромы органа и сосудов, незначительное количество мелких лимфоидных фолликулов, лимфоидные элементы различной степени зрелости. У животных опытной группы фиброзная капсула тонкая, лимфоидные фолликулы средних размеров с нечеткими границами, красная пульпа кровенаполнена, лимфоидные элементы различной степени зрелости.

Все вышеизложенное позволяет сделать следующие выводы:

- ранняя нормализация клинических показателей (отечность, гиперемия, боль, экссудация), лейкограммы, количества эритроцитов, уровня гематокрита, гемоглобина кроликов первой группы может свидетельствовать о противовоспалительном влиянии кафорсена, обусловленном фторидом кальция.

- незначительные различия в гистологической картине органов иммунной системы животных обеих групп указывает на отсутствие токсического влияния кафорсена на иммунокомпетентные органы.

Литература

1. Анников В.В. Анатомо-хирургические аспекты оптимизации репаративного остеогенеза в условиях внешней фиксации аппаратами стержневого типа. Дис. …д-ра ветер. наук. – Саратов, 2006. – 265с.

2. Анников В.В., Карпова А.И. Теоретическое обоснование эффективности кафорсена при переломах трубчатых костей. Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И.Вавилова. -2010. - №5. – С.3-6.

3. Бабаева А.Г., Зотиков Е.А. Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений.// М.: Наука, 1987. – 207с.

4. Ватников Ю.А. Структурная и функциональная организация репаративного остеогенеза животных// М.: Франтера. – 2004. – 144с.

5. Гессе И.Ю. Иммуноморфологические аспекты цитокиновой оптимизации репаративного остеогенеза у собак в условиях внешней стержневой фиксации. Дис. …канд. вет. наук. – Саратов, 2008. – 201с.

6. Донцов В.И. Регуляция лимфоцитами клеточного роста соматических тканей и новая иммунная теория старения.// Профилактика старения. – 1998. - №1. – С. 94-96.

7. Самошкин И.Б. Сравнительная оценка методов остеосинтеза при переломах длинных трубчатых костей у собак. Дис. … канд. вет. наук. – М., 1989. – 232с.

8. Horowitz M., Vignery A., Gershon R., Baron R. Thymus-derived lymphocytes and their interactions with macrophages are required for the production of osteoclast-activated factor in the mouse // Proc. Nat. Acad. Sci.USA.1984.V.81.P.2181.

9. Schneider G.B., Relbsom M. Immunological competence in osteopetrotic rets // Immunology. 1984. V. 167. P. 318.