Ребко С.В., Поплавская Л.Ф., Ивановская С.И.

Белорусский государственный технологический университет

Генетическое разнообразие гибридного потомства

сосны обыкновенной

Успешное решение проблемы повышения продуктивности лесных насаждений, улучшение качества и сокращение сроков выращивания древесины предполагает помимо общепринятых лесохозяйственных мероприятий использование достижений лесной селекции, в частности создание на основе географически отдаленной внутривидовой гибридизации ценных сортов и последующее их размножение.

Из всех категорий семян, заготавливаемых на лесосеменных объектах, наибольшей ценностью обладают гибридные семена, в широком масштабе заготовка которых вполне возможна на гибридно-семенных плантациях, однако уровень их генетического разнообразия должен быть довольно высоким и в максимально возможной степени приближаться к генетическому разнообразию природных популяций. Известно, что искусственное лесовосстановление в определенной степени приводит к изменению генетической структуры, поскольку направленный отбор обусловливает снижение уровня генетического полиморфизма [1]. Например, по данным В.Е. Падутова [2] и С.И. Ивановской и др. [3], на территории Беларуси генетическое разнообразие, наблюдаемое в природных популяциях сосны обыкновенной, находится на более высоком уровне по сравнению с клоновыми лесосеменными плантациями.

Цель данной работы заключалась в определении уровня генетического разнообразия гибридно-семенной плантации сосны обыкновенной Негорельского учебно-опытного лесхоза и ее семенного потомства в испытательных культурах.

Наиболее перспективным методом, позволяющим установить генетическое разнообразие, является метод электрофоретического анализа изоферментов. Метод разделения белков и ферментов в электрическом поле путем электрофореза имеет определенное преимущество, поскольку позволяет по числу и расположению окрашенных красителем белковых и ферментных фракций на специальной гелевой пластине судить о генах, имеющихся в каждом растении.

Для проведения генетического анализа изоферментов на клоновой гибридно-семенной плантации сосны обыкновенной и в испытательных культурах семенного потомства Негорельского учебно-опытного лесхоза был заготовлен семенной материал с 58 наиболее плодоносящих деревьев (27 деревьев семенной плантации и 31 дерево в испытательных культурах). Непосредственно в качестве экспериментального материала использовались гаплоидные ткани эндоспермов семян.

Исследование сосны обыкновенной методом электрофоретического анализа изоферментов проводили в 11-12% крахмальном геле. В качестве буферных систем были выбраны следующие: трис-ЭДТА-боратная, рН = 8,6 – электродный буфер включает 900 мM трис-(оксиметил)-аминометан, 500 мM борную кислоту, 20 мM ЭДТА, 40 мM MgCl₂, гелевый буфер готовится путем разведения 50 мл электродного буфера до объема в 1 л дистиллированной водой; трис-цитрат, рН = 6,2 / Трис-НСl, рН 8,0 – электродный буфер включает 233 мМ трис-(оксиметил)-аминометан и 86,15 мМ лимоную кислоту, гелевый буфер содержит 500 мМ трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид, рН доводят 1н. NaOH; трис-цитратная, рН = 6,2 – электродный буфер включает 233 мМ трис-(оксиметил)-аминометан, 86,15 мМ лимонную кислоту, гелевый буфер готовится путем разведения 35 мл электродного буфера до объема в 1 л дистиллированной водой.

Гомогенизация растительных тканей проводилась в матированных лунках специальных гомогенизаторов при температуре от 0 до 5⁰С при помощи специального стеклянного пестика.

Гистохимическое выявление определенного фермента осуществлялось в кюветах, содержащих специальный инкубационный раствор. Важнейшим компонентом гистохимического раствора является краситель, который вступает в соединение с продуктом ферментативной реакции и выпадает в виде нерастворимого осадка в местах локализации фермента. В некоторых случаях выявление ферментов в геле проводится при облучении электрофореграмм ультрафиолетовым светом. Под ультрафиолетовым светом анализировалась флюоресцентная эстераза и кислая фосфатаза, которые выявляются при помощи умбелифериловых субстратов. В ходе электрофоретического исследования все процессы гистохимического выявления ферментов проводились при температуре 30-37⁰С в темноте, поскольку красители чувствительны к свету.

Каждое дерево было исследовано по 19 ген-ферментным системам (глюкозофосфатизомераза – GPI, флюоресцентная эстераза – FL-EST, фосфоглюкомутаза – PGM-1, PGM-2, диафораза – DIA-1, DIA-2, глутаматдегидрогеназа – GDH, алкогольдегидрогеназа – ADH-1, ADH-2, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа – 6-PGD-2, малатдегидрогеназа – MDH-1, MDH-2, MDH-3, аспартатаминотрансфераза – AAT-1, AAT-2, лейцинаминопептидаза – LAP-1, LAP-2, изоцитратдегидрогеназа – IDH, шикиматдегидрогеназа – SDH).

Для определения уровня генетической изменчивости и описания генетической структуры гибридно-семенной плантации и ее семенного потомства рассчитаны статистические показатели [4].

Проведенный изоферментный анализ эндоспермов семян гибридно-семенной плантации показал, что из проанализированных 19 аллозимных генов полиморфными являются 15, у которых обнаружено 44 аллельные формы. Полностью мономорфными оказались четыре локуса: DIA-2, MDH-2, IDH, SDH. Анализ семенного потомства в испытательных культурах показывает, что мономорфными из 19 локусов оказались пять: DIA-2, MDH-2, IDH, SDH, AAT-1, а оставшиеся 14 являются полиморфными и насчитывают 40 аллельных вариантов.

«Нулевые» аллели, кодирующие неактивную форму фермента, были выявлены у одного локуса деревьев гибридно-семенной плантации и у двух локусов семенного потомства сосны обыкновенной в испытательных культурах.

В исследуемой выборке деревьев обнаружены также редкие и уникальные аллели, частота встречаемости которых не превышает 1%. По мнению В.Е. Падутова, наличие достаточно большого количества редких и уникальных аллелей является «отражением микроэволюционных процессов, активно происходящих в популяциях сосны обыкновенной» [2].

Выявленные аллельные варианты у сосны обыкновенной на гибридно-семенной плантации и в испытательных культурах Негорельского учебно-опытного лесхоза позволяют судить о генетическом полиморфизме.

На основании полученных на гибридно-семенной плантации и в испытательных культурах сосны обыкновенной аллельных частот рассчитаны показатели генетического разнообразия (табл. 1).

Таблица 1 – Значения показателей уровня генетического полиморфизма гибридного потомства сосны обыкновенной Негорельского учебно-опытного лесхоза и клоновых лесосеменных плантаций Беларуси

Объект, год создания	Полиморфность		Средняя гетерозиготность		Среднее число аллелей на локус
	Р95	Р99	Но	Не	А
Гибридно-семенная плантация сосны обыкновенной Негорельского учебно-опытного лесхоза, 1986 г.	0,579	0,789	0,213	0,211	2,32
Семенное потомство гибридно-семенной плантации Негорельского учебно-опытного лесхоза в испытательных культурах, 2002 г.	0,526	0,737	0,208	0,229	2,11
Клоновая лесосеменная плантация Петриковского лесхоза, 1993 г.	0,550	0,550	0,176	0,187	1,80
Клоновая лесосеменная плантация Петриковского лесхоза, 1996 г.	0,500	0,550	0,224	0,204	1,65
Клоновая лесосеменная плантация Калинковичского лесхоза, 1993 г.	0,500	0,600	0,209	0,205	2,10
Клоновая лесосеменная плантация Калинковичского лесхоза, 1995 г.	0,550	0,700	0,197	0,187	2,00
Клоновая лесосеменная плантация Мозырьского лесхоза, 1997 г.	0,500	0,700	0,238	0,219	2,30
Клоновая лесосеменная плантация Барановичского лесхоза, 1994 г.	0,550	0,700	0,204	0,207	2,15
Клоновая лесосеменная плантация Кобринского лесхоза, 1995 г.	0,600	0,850	0,215	0,214	2,25
Природные насаждения	0,600	0,700	0,227	0,220	2,90

Результаты исследований показали, что доля полиморфных локусов для гибридно-семенной плантации сосны обыкновенной Негорельского учебно-опытного лесхоза составляет 0,579 по 95% критерию и 0,789 по 99% критерию. Полученные значения этого показателя для гибридно-семенной плантации практически во всех случаях превышают аналогичные значения для клоновых лесосеменных плантаций Республики Беларусь, а по 99% критерию доля полиморфных локусов на указанной плантации значительно выше, чем в природных насаждениях. Определение наблюдаемой гетерозиготности показало, что деревья клоновой гибридно-семенной плантации имеют 0,213 локусов в гетерозиготном состоянии, что является средним показателем среди исследуемых объектов. Ожидаемая гетерозиготность равна 0,211, что указывает на отсутствие давления отбора у представленных деревьев.

Полиморфность локусов у деревьев семенного потомства гибридно-семенной плантации составляет 0,526 по 95% критерию и 0,737 по 99% критерию, что незначительно меньше гибридно-семенной плантации. Показатель наблюдаемой гетерозиготности в испытательных культурах равен 0,208, что является средним показателем среди исследуемых объектов. Ожидаемая гетерозиготность равна 0,229, являясь самым высоким показателем среди выбранных исследуемых объектов, превышая аналогичный показатель природных насаждений (0,229>0,220). Данный показатель показывает реальную частоту гетерозигот, если деревья данной популяции находятся в равновесии и отсутствуют механизмы отбора.

Таким образом, характеризуя полиморфизм гибридно-семенной плантации Негорельского учебно-опытного лесхоза, важным является наличие достаточно высокого запаса генетической изменчивости. Так, более 75% локусов деревьев плантации находится в полиморфном состоянии, причем количество аллелей на локус составляет 2,32, а каждое дерево гетерозиготно по 21,3% своих генов. Примерно такой же полиморфностью характеризуется гибридное потомство, поставленное на испытание в испытательных культурах. Здесь также более 70% локусов деревьев являются полиморфными, количество аллелей на локус составляет 2,11, а гетерозиготными у деревьев являются 20,8% генов.

Литература.

1. Lundkvist, К. Genetic structure in natural and cultivated forest tree populations / К. Lundkvist // Silva Fennica. – 1982. – Vol. 16. – P. 141–149.

2. Падутов, В.Е. Генетические ресурсы сосны и ели в Беларуси / В.Е. Падутов. – Гомель: ИЛ НАН Беларуси, 2001. – 144 с.

3. Ивановская, С.И. Молекулярно-генетический анализ Pinus sylvestris на лесосеменных плантациях / С.И. Ивановская, Е.Н. Химченко, О.М. Новикова // Сб. науч. тр. / Ин-т леса НАН Беларуси. – Гомель, 2007. – Вып. 67: Проблемы лесоведения и лесоводства. – С. 155–162.

4. Гончаренко, Г.Г. Руководство по исследованию хвойных видов методом электрофоретического анализа изоферментов / Г.Г. Гончаренко, В.Е. Падутов, В.В. Потенко. – Гомель: БелНИИЛХ, 1989. – 164 с.