Батушанский А.М., Дубовик Л.В., Квач С.В., Ерошевская Л.А.,

Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

СОЗДАНИЕ НУКЛЕАЗОУСТОЙЧИВЫХ ДНК-СОДЕРЖАЩИХ СТРУКТУР

Известно, что бактериальная ДНК содержит т.н. «CpG-мотивы» – особые шестичленные последовательности нуклеотидов, в центре которых расположен СpG-динуклеотид. При введении в организм позвоночных таких CpG-мотивов, например, в виде бактериальной ДНК или химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов, они действуют как сигнал опасности для клеток иммунной системы и активируют не только врожденную систему неспецифической защиты от патогенов, но и приводят к активации приобретенного иммунного ответа [1, 2].

В ряде работ описана эффективность геномной и плазмидной бактериальной ДНК в качестве адъювантов, усиливающих действие различных вакцин в лечении аллергических реакций и вирусных заболеваний, а также злокачественных новообразований [3, 4].

На сегодняшний день не решена проблема эффективной доставки бактериальной ДНК в клетки млекопитающих. Так как свободная бактериальная ДНК подвергается атаке нуклеаз, эффект от ее введения в организм млекопитающих низок. В настоящее время разрабатываются методы доставки ДНК в клетку с помощью липосом, а также в качестве комплексов с различными неорганическими носителями [5, 6].

Целью данной работы являлось создание нуклеазоустойчивых ДНК-карбонатапатитных комплексов [7] для рН-зависимого внутриклеточного высвобождения нуклеиновой кислоты.

Материалы и методы. В работе использовалась геномная ДНК, выделенная из штамма E. coli DH5α. Наработка нуклеиновой кислоты осуществлялась по стандартной методике [5]. В результате было выделено 2 мг геномной ДНК со следующими характеристиками: Е₂₆₀:Е₂₈₀=1,8; Е₂₆₀:Е₂₃₀=2,2.

Препарат ДНК растворяли в ТЕ-буфере (рН 7,5) до концентрации 0,6 мг/мл и хранили при -20ºС.

Для получения нуклеазоустойчивых структур 5 мкл раствора геномной ДНК (0,6 мг/мл) добавляли к помещенным в пластиковую пробирку 40 мкл 1 М CaCl₂ и аккуратно перемешивали, после чего в пробирку добавляли 500 мкл раствора I (рН 7,5), содержащего 80 мМ NaHCO₃ и 9 мМ NaH₂PO₄. Затем пробирку помещали в термостат на 37ºС и инкубировали 30 мин, по истечении которых смесь центрифугировали 10 мин при 10000 g.

Контроль связывания ДНК и неорганических ионов, а также проверка устойчивости образованного комплекса к ДНКазе I из поджелудочной железы быка (Serva, Германия) проводили с помощью электрофореза в агарозном геле.

Полученный комплекс проверяли на стабильность путем повторного электрофоретического исследования спустя 24 час после его образования. Устойчивость комплекса при нейтральных pH и возможность его распада при кислых pH также проверяли с помощью гель-электрофореза.

Контроль за возможной агрегацией частиц осуществляли измерением поглощения раствором света с длинной волны 320 нм [7].

Результаты и обсуждение. В ходе получасового инкубирования смеси, содержащей геномную ДНК, CaCl₂, NaHCO₃ и NaH₂PO₄, предполагаемое формирование нуклеазоустойчивых ДНК-содержащих частиц происходило по схеме, представленной на рис. 1.

В процессе нагревания, происходит замена атомов хлора в молекулах CaCl₂ на карбонатные группы с одновременным связыванием отрицательно заряженных молекул ДНК с несущими положительный заряд ионами Ca²⁺. В результате образуются сферические структуры (предположительно наноразмеров [7]), в которых ДНК располагается внутри частиц. Такая локализация ДНК защищает ее от действия нуклеаз (рис. 2).

Рис. 1. Предполагаемая схема образования и диссоциации ДНК-содержащих наночастиц

Рис. 2. Электрофоретический анализ инкубационной смеси после формирования в ней ДНК-карбонатапатитных комплексов.

1 – Свободная ДНК; 2 – супернатант, полученный после центрифугирования реакционной смеси при 10 тыс. g 10 мин; 3 – осадок ДНК-карбонатапатитных частиц (0,05 мкг ДНК); 4 – свободная ДНК (0,05 мкг) после 10 мин инкубирования с ДНКазой (360 ед); 5 – ДНК-карбонатапатитные частицы (0,05 мкг ДНК) после 10 мин инкубирования с ДНКазой (360 ед).

Образованные частицы проявляют стабильность при нейтральных значениях рН среды, но высвобождать ДНК в кислых условиях (рис. 3).

Рис. 3. Электрофоретический анализ рН-стабильности ДНК-карбонатапатитного комплекса.

1 – ДНК (0,05 мкг); 2 – супернатант, полученный после центрифугирования ДНК-карбонатапатитного комплекса (0,05 мкг ДНК), ресуспендированного в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7,0; 24 ч); 3 – супернатант, полученный после центрифугирования ДНК-карбонатапатитного комплекса (0,05 мкг ДНК), ресуспендированного в 0,01 М HCl (рН 2,5; 5 мин).

Полученные ДНК-содержащие частицы не агрегируют между собой, что было показано методом спектрофотометрии при длине волны 320 нм (табл. 1).

Таблица 1 – Изменение оптической плотности раствора кальций-карбонатных наночастиц с течением времени при длине волны 320 нм

Продолжительность инкубирования, мин	Оптическая плотность
0	2,635
15	2,638
30	2,636

Таким образом, в настоящей работе были получены ДНК-карбонатапатитные комплексы, которые возможно использовать для доставки в клетки млекопитающих богатой CpG-мотивами геномной бактериальной ДНК. Показана устойчивость полученных комплексов к действию ДНКазы, стабильность при хранении в среде с нейтральными значениями рН и способность к диссоциации в кислой среде.

Литература:

1. Krieg A.M. Antiinfective application of Toll-like receptor 9 agonists // Proc. Am. Thorac. Soc. 2007. Vol. 4. P. 289–294.

2. Lanzavecchia A., Sallusto F. Toll-like receptors and innate immunity in B-cell activation and antibody responses // Curr. Opin. Immunol. 2007. Vol. 19. P. 268–274.

3. Kojima Y., Xin K., Ooki T. et al. Adjuvant effect of multi-CpG motifs on an HIV-1 DNA vaccine // Vaccine. 2002. Vol. 20. P. 2857–2865.

4. Schneeberger A., Wagner C., Zemann A. et al. CpG motifs are efficient adjuvants for DNA cancer vaccines // J. Invest. Dermatol. 2004. V. 123. P. 371–379.

5. Wilson K., Raney S.G., Sekirov L. et al. Effects of intravenous and subcutaneous administration on the pharmacokinetics, biodistribution, cellular uptake and immunostimulatory action of CpG ODN encapsulated in liposomal nanoparticles // Int. Immunopharm. 2007. Vol. 7. P. 1064–1075.

6. Xu Z.P., Zeng Q.H., Lu G.Q., Yu A.B. Inorganic nanoparticles as carriers for efficient cellular delivery // Chem. Eng. Sci. 2006. Vol. 61. P. 1027–1040.

7. Chowdhury E.H., Maruyama A., Kano A. et al. pH-sensing nano-crystals of carbonate apatite: Effects on intracellular delivery and release of DNA for efficient expression into mammalian cells // Gene. 2006. Vol. 376, N 1. P. 87–94.

8. Sambrook J., Frittsch E., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. – 2-nd ed. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.