Квач С.В.,
Ерошевская Л.А., Зинченко А.И.
Институт
микробиологии НАН Беларуси, Минск
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСПРЕССИИ штамма-суперпродуцента аденозиндезаминазы Escherichia coli
Аденозиндезаминаза (АД; КФ 3.5.4.4) – фермент,
играющий важную роль в метаболизме пуриновых нуклеозидов, катализирует
необратимую реакцию превращения аденозина в инозин путем отщепления NH2-группы
от гетероциклического основания нуклеозида. Помимо своего основного субстрата –
аденозина, АД Escherichia coli может использовать ряд других природных и
модифицированных нуклеозидов – 2’-дезоксиаденозин, 3’-дезоксиаденозин,
2’,3’-дидезоксиаденозин, 6-метил-аминопуринрибозид, 2,6-диаминопуринрибозид
[1,2]. Способность АД дезаминировать модифицированные пуриновые нуклеозиды
делает его привлекательным для использования в химико-ферментативных схемах
получения различных субстанций с потенциальной фармакологической активностью.
Объекты и
методы исследования. Объектами
исследований служили штаммы Белоруской коллекции непатогенных микроорганизмов: E. coli БМТ-4Д/1А – донор гена add,
кодирующего АД; E. coli BL21(DE3), использующийся
для получения генно-инженерного суперпродуцента АД; E. coli DH5α – промежуточный хозяин для наработки и анализа
рекомбинантного вектора.
Культивирование всех штаммов проводилось при температуре
37oС на стандартной среде LB (рН 7,2), содержащей (%):
триптон 1,0; NaCl 1,0; дрожжевой экстракт 0,5.
Штаммы, содержащие плазмиды и векторы на их основе, культивировались на среде с
добавлением 50 мкг/мл канамицина.
Клетки E. coli
BL21(DE3), несущие плазмиду с геном add, выращивали на LB-среде до оптической плотности 0,6
(λ = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения IPTG
до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 24 ч. После
добавления индуктора через равные промежутки времени отбирали по 1 мл культуры
и определяли выход биомассы и активность АД. При использовании в качестве
индуктора α-D-лактозы, ее вносили в культуру в
концентрациях 0,2, 0,4, 0,8, и 1,6%.
Изучение аутоиндукции проводили с использованием среды
ZYM5052 согласно рекомендациям Studier [3].
Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили
по методу Лэммли [4] с использованием 3%-ого концентрирующего и 10%-го разделяющего
гелей.
Для амплификации гена add использовали праймеры addF – GCCCGACATATGATTGATACCACCCTGCCA и addR – CGGGATCCCG-TTACTTCGCGGCGACTTTTTC. На
5’-концах праймеров были встроены сайты рестрикции NdeI и BamHI. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза
в 1%-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену add,
выделяли и лигировали в вектор pET24b+, также рестрицированный по NdeI и BamHI и обработанный щелочной фосфатазой.
Активность АД определяли по скорости дезаминирования
аденозина [1]. За единицу активности фермента принимали такое его количество,
которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в соответствующих
условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мл культуральной жидкости и
ед/мг сухой биомассы клеток.
Результаты и
их обсуждение. В настоящей работе
получена конструкция, состоящая из гена add, встроенного в вектор pET24b+ (Novagen,
США). В результате ген add был
поставлен под контроль Т7-промотора
(сильного промотора 10-го гена капсида фага Т7). Полученной плазмидой
трансформировали клетки E. coli BL21(DE3), предназначенные для экспрессии белка, находящегося под контролем T7-промотора.
Полученный штамм был назван E. coli:pADD3.
На первом этапе работы изучали зависимость степени
продуцирования целевого фермента в штамме E. coli:pADD3 при индукции 1 мМ IPTG (рекомендуемая концентрация индуктора для данной
системы экспрессии) от времени культивирования (табл. 1). Из табличных данных
видно, что максимальный уровень накопления фермента (47,3 ед/мг) происходит
через 7 ч после начала индукции (10 ч после начала культивирования). При дальнейшем
культивировании активность фермента падает и к 24 ч составляет 40% от
максимальной. Таким образом, показано, что для получения максимального выхода
генно-инженерной АД (при использовании IPTG в качестве индуктора) целесообразно проводить
индукцию с помощью 1 мМ IPTG в течение 7
ч.
Таблица 1 – Зависимость активности АД от
времени индукции
|
Время после индукции с помощью 1 мМ IPTG, ч |
Клеточная биомасса, мг/мл |
Активность АД, ед/мг |
Активность АД, ед/мл |
|
0 |
0,40 |
0,00 |
0,00 |
|
1 |
1,04 |
1,3 |
1,35 |
|
2 |
1,46 |
4,0 |
5,84 |
|
3 |
1,88 |
5,8 |
10,90 |
|
4 |
1,98 |
11,0 |
21,78 |
|
5 |
2,00 |
19,0 |
38,00 |
|
6 |
2,20 |
46,0 |
101,20 |
|
7 |
2,20 |
47,3 |
104,06 |
|
8 |
2,20 |
43,4 |
95,40 |
|
22 |
2,36 |
18,6 |
43,80 |
На следующем этапе была изучена возможность экспрессии
АД с использованием в качестве индуктора не только обычно применяемого в таких
случаях известного аналога лактозы – IPTG, но
также и самой лактозы, которая является более дешевым соединением, что играет
немаловажную роль при препаративных получениях белка.
Применение лактозы для экспрессии белков, имеющих lac-зависимые промоторы, до настоящего времени ограничено
единичными сообщениями. Так, в некоторых исследованиях было показано, что
внесение лактозы в концентрации 0,2–0,4% приводит к экспрессии ряда
рекомбинантных белков на уровне, сопоставимом с экспрессией под действием IPTG [5, 6].
Кроме использования в качестве индуктора
лактозы, существует еще один подход – аутоиндукция [3]. В данном методе также в
качестве индуктора используется 0,2% лактоза, однако она вноситься изначально в
среду для культивирования в смеси с глюкозой (0,05%). В работе [3] было
показано, что при наличии глюкозы в данной концентрации клетки растут
эффективно, но по причине катаболитной репрессии усвоение лактозы клетками и
превращение ее в аллолактозу, которая и является истинным индуктором lac-оперона, не наблюдается. В процессе роста
клеток происходит метаболизм всей глюкозы, катаболитная репрессия снимается и
лактоза начинает усваиваться, тем самым запуская процесс индукции. Данный метод
удобен (нет необходимости постоянно контролировать оптическую плотность
культуры и дополнительно вносить индуктор) и дает большие выходы как биомассы,
так и фермента по сравнению с традиционным методом индукции с помощью IPTG. Результаты экспериментов по индукции
экспрессии add с помощью
лактозы и с применением метода аутоиндукции суммированы в табл. 2.
Таблица 2 – Активности АД при индукции
синтеза белка лактозой и при использовании метода аутоиндукции
|
Лактоза, % |
Максимальная активность АД |
Биомасса клеток, мг/мл |
|
|
ед/мг |
ед/мл |
||
|
0,2 |
43,2 |
90,7 |
2,1 |
|
0,4 |
46,1 |
110,6 |
2,4 |
|
0,8 |
46,9 |
126,6 |
2,7 |
|
1,6 |
46,3 |
120,4 |
2,6 |
|
Аутоиндукция |
45,5 |
127,4 |
2,8 |
Из данных таблицы видно, что с увеличением
концентрации лактозы происходит незначительное увеличение активности АД в
расчете на мг сухих клеток с оптимумом при 0,8%. Применение метода аутоиндукции
позволило добиться наибольшего выхода биомассы клеток с единицы объема
культуральной жидкости и, как следствие, наибольшего выхода целевого фермента.
Поскольку данный метод – наименее трудоемкий и дает максимальные выходы фермента,
его можно рекомендовать в качестве основного подхода для получения АД в
препаративных количествах.
Таким образом, в данной работе
сконструирован штамм E.
coli:pADD3, эффективно продуцирующий АД E. coli. Проведена оптимизация условий культивирования и индукции синтеза
генно-инженерного белка в полученном штамме. Показано, что экономически
наиболее эффективным для наработки биомассы с высокой ферментативной
активностью является метод аутоиндукции.
Литература:
1.
Nygaard, P. Adenosine deaminase from Escherichia coli / P. Nygaard //
Methods Enzymol. – 1978. – Vol. 51. – P. 508–512.
3.
Studier, F.W. Protein production
by auto-induction in high-density shaking cultures / F.W. Studier // Protein Expr. Purif. – 2005. – Vol.
41, № 1. – P. 207–234.