Квач С.В.¹, Ерошевская Л.А.¹, Шахбазов А.В.², Картель Н.А.²,

Зинченко А.И.¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

²Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск

ПОЛУЧЕНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСПРЕССИИ штамма-суперпродуцента тимидинфосфорилазы Escherichia coli

Модифицированные нуклеозиды нашли широкое применение в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях. Однако наиболее важной областью их применения является медицина. Так, на основе модифицированных нуклеозидов уже создан целый ряд высокоэффективных противовирусных (ацикловир, виразол, видарабин, азидотимидин и др.) и противоопухолевых (кладрибин, флударабин, гемцитабин, цитазар и др.) лекарственных препаратов и постоянно ведется целенаправленный поиск новых высокоактивных нуклеозидов [1,2].

Оптимальными биокатализаторами при получении модифицированных нуклеозидов являются ферменты – нуклеозидфосфорилазы (КФ 2.4.2.3). Нуклеозидфосфорилазы Escherichia coli представлены тремя ферментами: уридинфосфорилазой, тимидинфосфорилазой (ТФазой), использующими в качестве субстратов пиримидиновые нуклеозиды, и пуриннуклеозидфосфорилазой, субстратами которой являются пуриновые нуклеозиды.

Целью данной работы было повышение уровня экспрессии ТФазы E. сoli – фермента, катализирующего обратимый фосфоролиз тимидина и широкого ряда его модифицированных аналогов, путем клонирования гена tpp в составе плазмиды pET24b+ в клетках E. coli.

Объекты и методы исследования. Ген tpp, кодирующий ТФазу, был выделен методом ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штамма E. coli БМТ-4Д/1А [1]. Для амплификации гена tpp использовали следующую пару праймеров: «прямой» – (5'-GGAATTCATATGTTGTTTCTCGCACAA-3') и «обратный» – (5'-TTTTGTCGACTTATTCGCTGATACGG-3'). В 5'-конец прямого праймера был встроен сайт рестрикции эндонуклеазы NdeI, а в обратный праймер – сайт узнавания рестриктазы SalI (выделены жирным шрифтом). Для проведения реакции амплификации использовали 1 ед. активности Fusion HF-полимеразы (New England Biolab, США). Синтезированный с помощью ПЦР продукт выделяли из геля, используя набор реактивов «Wizard SV gel and PCR clean-up system» (Promega, США), согласно методике фирмы-изготовителя, обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и SalI и полученную вставку с геном tpp лигировали в вектор pET24b+, содержащий T7-промотор (Novagen, США). В результате была сконструирована плазмида pETtdp, несущая ген tpp. Этим вектором были трансформированы клетки E. coli BL21(DE3) с получением нового штамма, обозначенного E. coli TDP.

Клетки E. coli TDP выращивали на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл канамицина, до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм); затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до концентрации 0,2, 0,4 и 1,0 мМ и продолжали культивирование в течение 5 ч. При использовании в качестве индуктора α-D-лактозы, ее вносили в среду для культивирования вместо IPTG в концентрациях 0,2%, 0,4% и 1%.

В процессе культивирования отбирались аликвоты культуры (1 мл), клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 5000 × g. Полученный в результате центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5).

Активность ТФазы определяли спектрофотометрически по изменению поглощения при фосфоролизе тимидина (λ=300 нм) [3].

За единицу активности ТФазы принимали такое её количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в условиях проведения реакции.

Результаты и их обсуждение. Ген tpp, кодирующий ТФазу E. coli был изолирован с использованием ПЦР с применением высокоточной Fusion HF-полимеразы и встроен в плазмиду pET24b+ вниз от Т7 промотора. Индукция экспрессии белка в данной конструкции обеспечивается добавлением в среду IPTG.

Как известно из литературных данных, оптимальная концентрация IPTG для максимальной индукции синтеза белка в pET-системе может варьироваться в широких пределах (0,2–1,0 мМ) [4]. Оптимальная концентрация зависит как от используемого вектора и штамма реципиента, так и от токсичности экспрессирующегося белка. В общем случае она подбирается эмпирически экспериментальным путем. Для используемого нами вектора pET24b+ в качестве начальной рекомендуется 1,0 мМ концентрация IPTG [4]. Поскольку данное соединение является достаточно дорогостоящим, нами было проведено изучение влияние его концентрации на эффективность экспрессии ТФазы. Результаты эксперимента приведены на рисунке 1.

Из рисунка 1 видно, что увеличение концентрации IPTG приводит к заметному увеличению продукции ТФазы. Максимальная активность ТФазы (61 ед/мг) достигается при индукции с помощью 1,0 мМ IPTG. Также видно, что максимальная активность при индукции любой концентрацией IPTG достигается через 4 ч, а затем резко падает.

Данные по максимальной активности, отнесенной на мг сухой клеточной биомассы, и по выходу ТФазы с единицы объема культуральной среды приведены в табл. 1.

Таблица 1 – Продуцирование ТФазы E. coli TDP в зависимости от концентрации IPTG в питательной среде

Концентрация IPTG, мМ	Биомасса, мг/мл	Максимальная активность ТФазы
		ед/мг	ед/мл
1,0	1,18	61,0	72,0
0,4	1,32	54,0	71,3
0,2	1,32	48,3	63,8

Из данных табл. 1 видно, что максимальный выход фермента (72 ед/мл) достигается при индукции с помощью 1,0 мМ IPTG. Тем не менее, при индукции 0,4 мМ IPTG этот показатель (71,3 ед/мл) лишь немного уступает таковому, достигаемому при индукции 1,0 мМ IPTG, в то время как количество дорогостоящего индуктора снижается в 2,5 раза.

На следующем этапе была изучена возможность экспрессии ТФазы с использованием в качестве индуктора не только обычно применяемого в таких случаях известного аналога лактозы – IPTG, но также и самой лактозы, которая является более дешевым соединением, что играет немаловажную роль при получении белка в препаративных количествах.

В настоящем исследовании для проверки возможности использования лактозы в качестве индуктора экспрессии ТФазы ее вносили в концентрациях 0,2%, 0,4% и 1,0%. Результаты этого эксперимента представлены в табл. 2.

Таблица 2 – Продуцирование ТФазы E. coli TDP в зависимости от концентрации лактозы в питательной среде

Лактоза, %	Активность ТФазы		Биомасса клеток, мг/мл
	ед/мг	ед/мл
0,2	115,3	184,5	1,6
0,4	139,5	251,1	1,8
1,0	124,1	186,2	1,5

Из табличных данных видно, что степень индукции ТФазы зависит от концентрации лактозы. Наибольшая активность фермента (как в ед/мг, так и в ед/мл) достигается при использовании 0,4% лактозы. Важно отметить, что при использовании лактозы в любой из проверенных концентраций выход фермента в расчете на единицу биомассы клеток значительно превышает таковой при использовании 1,0 мМ IPTG (см. табл. 1). Выход ТФазы с единицы объема культуральной среды составил 251,1 ед/мл при использовании 0,4% лактозы, что в 3,5 раза выше, чем при использовании оптимальной концентрации IPTG.

Таким образом, нами получен генно-инженерный штамм E. coli – суперпродуцент ТФазы и показано, что для получения биомассы с наибольшей активностью фермента в качестве индуктора целесообразно использовать лактозу в концентрации 0,4%.

Литература:

1. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Kalinichenko E.N., Kulak T.I., Mikhailopulo I.A. // Helvetica Chimica Acta. 2002. Vol. 85, N 7. P. 1901–1908.

2. Mikhailopulo I.A. // Curr. Organic Chem. 2007. Vol. 11, № 4. P. 317–335.

3. Razzel W.E., Khorana H.G. // Biochim. Biophys. Acta. 1958. Vol. 28, № 3. P. 562–566.

4. http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf // The pET system manual 11^th Edition.