Кухарская Т.А., к.б.н. Ерошевская Л.А., к.х.н. Кулак Т.И.*,

д.х.н. Калиниченко Е.Н.*, д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

*Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

Получение Иммобилизованного комплекса

(3'-5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза

(2'-5')-Олигоаденилаты представляют собой олигонуклеотиды, состоящие из нескольких фрагментов аденозина, связанных между собой не канонической (3'-5')-, а изомеризованной (2'-5')-фосфодиэфирной связью. Эти соединения обладают разнообразной биологической активностью, среди которых наибольшее внимание привлекает активностью против вирусов растений и животных [1–4].

Главными недостатками химических способов получения (2'-5')-олигоаденилатов является их нетехнологичность [5]. На наш взгляд, более перспективным является химико-ферментативный метод получения, предложенный Карпейским [6]. Метод предусматривает химическую полимеризацию аденозин-2'(3')-монофосфата, приводящую к полиадениловой кислоте, содержащей как (3'-5')-, так и (2'-5')-межнуклеотидные связи (далее (3'-5')/(2'-5')-поли-А. Обработка такого полимера рибонуклеазой Penicillium brevicompactum, гидролизующей только (3'-5')-межнуклеотидные связи, и щелочной фосфатазой Еscherichia coli, дефосфорилирующей олигонуклеотиды, приводит к образованию смеси (2'-5')-олигоаденилатов.

Ранее мы селектировали штаммы гриба Spicaria violacea (синоним Paecilomyces marquandii), фильтрат культуральной жидкости (ФКЖ) которого содержат фосфатазу и особую нуклеазу, способную гидролизовать (3'-5')-, но не (2'-5')-фосфодиэфирные связи [7]. С использование ферментов этого гриба был разработан способ химико-ферментативного получения (2'-5')-олигоаденилатов, заключающийся в избирательном гидролизе химически синтезированного полиаденилата, содержащего (3'-5')- и (2'-5')-межнуклеотидные фосфодиэфирные связи [8]. Цель настоящей работы заключалась в получения активного и стабильного катализатора, который можно было бы многократно использовать в синтезе (2'-5')-олигоаденилатов.

Объекты и методы исследования. В работе использовали штамм гриба Paecilomyces marquandii БИМ F-351Д (Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов). Условия культивирования гриба и получение ФКЖ описаны нами в работе [9]. (2'-5')/(3'-5')-поли-А получали полимеризацией аденозин-2'(3')-монофосфата в диоксане [6].

Активность изучаемого комплекса ферментов определяли по скорости накопления аденозина при гидролизе (2'-5')/(3'-5')-поли-А. Для этого смесь (0,5 мл), содержащую 5 мг/мл (2'-5')/(3'-5')-поли-А в 0,1 М Na-ацетатном буфере (рН 6,0), 10 мМ MgCl₂ и 250 мкл ФКЖ Р. marquandii, инкубировали 2 ч при 50^оС. В процессе реакции аликвоты смеси подвергали тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol-UV₂₅₄ (Serva, Германия) в системе растворителей изопропанол – 25%-ный аммиак – вода (7:1:2). За единицу активности ферментативного комплекса принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 нмоль продукта за 1 ч реакции.

Иммобилизацию ферментов на Биогеле Р-300 «Bio-Rad» (США) осуществляли, согласно методу, описанному в работе [10]. Для иммобилизации ферментов на фосфоцеллюлозу (ФЦ) к 50 мг смолы в Н⁺-форме добавляли 0,5 мл ФКЖ гриба и смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре с периодическим встряхиванием. ФЦ от жидкости отделяли фильтрованием.

Результаты и обсуждение. Преимущества гетерогенных катализаторов перед растворимыми ферментами общеизвестно и неоднократно рассматривались в литературе [11]. При этом немаловажной задачей при решении проблемы получения иммобилизованных ферментов является выбор подходящего носителя. Из требований, обычно предъявляемых к носителю, следует отметить следующее: он не должен инактивировать фермент, он должен обладать гидрофильностью и механической устойчивостью. В настоящее время имеется широкий выбор носителей для ферментов – органических и неорганических. Для каждого конкретного случая выбор носителя производится эмпирически.

На начальном этапе работы нами была предпринята попытка использовать химический метод иммобилизации с применением активированного глутаровым альдегидом (ГА) Биогеля Р-300. Выбор ГА для указанного исследования был обусловлен тем, что, во первых, этот бифункциональный реагент способен стабилизировать различные ферменты [12, 13]. Во вторых, ГА быстро реагирует с белками в мягких условиях проведения реакции и, вероятно, является среди таких соединений наименее токсичным [10].

Результаты экспериментов по иммобилизации ферментативного комплекса на Биогель представлены в табл. 1. Видно, что только 20% от исходной ферментативной активности, присутствующей в ФКЖ, связывается с активированной матрицей. 30% активности вообще теряется во время иммобилизации.

Таблица 1 − Иммобилизация ферментного комплекса на Биогель

Длительность процесса иммобилизации, ч	Комплекс, связавшийся матрицей, % от исходной активности	Комплекс, не связавшийся с матрицей, % от исходной активности
1	20	50
3	21	50
6	23	45
18	23	40

Проведение реакции при 4^оС не привело к увеличению эффективности иммобилизации, а введение дополнительной стадии промывки геля привело к потере активности, что говорит о слабой сорбции ферментов с помощью данного метода. Это может быть связано с малым количеством реакционноспособных остатков в ферменте, способных связываться с сорбентом с помощью ГА.

Одним из удобных методов иммобилизации ферментов является их фиксация на ионообменных матрицах, в частности на ФЦ. Метод основан на том, что фермент содержит ряд функциональных положительно заряженных групп, которые могут принимать участие в образовании ионной связи с отрицательно заряженными остатками фосфорной кислоты, закрепленными на целлюлозе.

Рисунок иллюстрирует результаты эксперимента, в котором изучалось влияние рН среды при иммобилизации ферментов на операционную стабильность иммобилизованного ферментного комплекса. С этой целью к аликвоте ФЦ с иммобилизованными ферментами добавляли субстрат и вели гидролиз в течение 15 мин. Затем реакционную смесь центрифугировали и к сорбенту повторно добавляли свежий субстрат. Видно, что ферменты хорошо связываются с матрицей в широком интервале рН, но наибольшую операционную стабильность проявляют образцы, полученные с использованием рН в пределах 5–7.

Рисунок – Влияние рН на иммобилизацию ферментного комплекса.

А – число катализируемых циклов с выходом целевого продукта >95%

В ходе следующего эксперимента, для выяснения наиболее оптимального температурного режима реакции гидролиза (2'-5')/(3'-5')-поли-А, её проводили при трех разных температурах. Данные этих экспериментов представлены в табл. 2.

Таблица 2 − Влияние температуры на операционную стабильность иммобилизованного ферментного комплекса

Температура гидролиза, ^оС	Выход реакции, %
	Циклы
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
40	>95	>95	75	66	61	59	51	50	40	37
50	>95	>95	>95	>950	>95	72	62	50	47	40
60	>95	>95	71	50	48	45	40	31	27	20

Как видно их данных, представленных в табл. 2, наиболее благоприятной для иммобилизованного ферментного комплекса оказалась температура 50^оС, при которой он способен провести 5 циклов гидролиза субстрата без снижения эффективности этого процесса.

Таким образом, в результате выполненных исследований получен препарат иммобилизованного ферментного комплекса, состоящего из (3'-5')-специфической нуклеазы и фосфатазы, который способен проводить 5 циклов гидролиза (3'-5')/(2'-5')-поли-А до смеси (2'-5')-олигоаденилатов без потери эффективности.

Литература:

1. Devash, Y. Maltiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf disks is inhibited by (2′-5′)oligoadenylate / Y. Devash, S. Biggs, I. Sela // Science. – 1982. – Vol. 216, № 4553. – P. 1415–1416.

2. Kara, J. Изучение антивирусного и антиклеточного действия синтетического (2′-5′)-олигоаденилата (A2′p5′A2′p5′A) на мышах с лейкемией Раушера / J. Kara, O. Mach, J. Smrt // Acta Virol. – 1983. – Vol. 27, № 6. – P. 477–483.

3. 5'-dephosphorylated 2',5'-adenylate trimer and its analogs. Inhibition of tobacco mosaic virus replication in tobacco mosaic virus-infected leaf discs, protoplasts, and intact tobacco plants / Y. Devash [et al.] // J. Biol. Chem. – 1984. Vol. 259, № 6. – P. 3482–3486.

4. Кaнавалава, Г.I. Выкарыстанне iнгiбiтарау вiрусау пры аздарауленнi бульбы метадам культуры тканкi / Г.I. Кaнавалава // Весцi АН Беларусi. Сер. бiял. навук. – 1990, № 6. – С. 70–72.

5. Nucleotides. XXIV. Preparative synthesis of trimeric (2'-5')oligoadenylic acid / E.I. Kvasyuk [et al.] // Synthesis. – 1987. – № 6. – P. 535–541.

6. Применение нуклеаз для синтеза 2′-5′-олигоаденилатов и их аналогов / М.Я. Карпейский [и др.] // Биоорган. химия. – 1983. – Т. 9, № 4. – С. 496–504.

7. Присутствие нуклеазы, специфичной к (3'–5')-межнуклеотидным фосфодиэфирным связям, в культуральной жидкости мицелиального гриба Spicaria violacea / Т.А. Кухарская [и др.] // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: материалы Междунар. конф., Минск-Раков, 1–2 июня 2006 г. – Минск, 2006. – С. 171–173.

8. Химико-энзиматический синтез 2′,5′-олигоаденилатов с использованием нуклеазы мицелиального гриба Spicaria violacea / Т.И. Кулак [и др.] // Химия природных соединений. – 2007. – № 2. – С. 200–201.

9. Факторы, влияющие на образование комплекса (3'−5')-специфическая нуклеаза/фосфатаза грибом Spicaria violacea / Т.А. Кухарская [и др.] // Умение и нововъведения – 2007: материали за 3-а Междунар. научна практична конференция, София, 16–31 отомври 2007 г. – Т. 12. – С. 9–13.

10. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / под ред. И.В. Березина. – М.: Мир, 1983. – 213 с.

11. Santos, A.M. Modeling thermal stability and activity of free and immobilized enzymes as a novel tool for enzyme reactor design / A.M. Santos, M.G. Oliveira, F. Maugeri // Bioresour. Technol. – 2007. – Vol. 98, № 16. – Р. 3142–3148.

12. Khan, S.S. Studies on chemically aggregated pepsin using glutaraldehyde / S.S. Khan, A.M. Siddiqi // Biotechnol. Bioeng. – 1985. – Vol. 27, № 4. – P. 415–419.

13. Зинченко, А.И. Увеличение операционной стабильности клеток Escherichia coli, катализирующих реакцию синтеза аденинарабинозида, с помощью глутарового альдегида / А.И. Зинченко, Л.А. Ерошевская, В.Н. Барай // Биотехнология. – 1990. – № 5. – С. 36–39.