Микитюк О.Ю.¹, Слипанюк О.В.²

¹Вищий державний навчальний заклад України «Буковинський державний медичний університет», Україна

²Державний вищий навчальний заклад "Прикарпатський національний університет ім. В. Стефаника", Україна

Застосування хемілюменісцентного аналізу у медицині і біології

Хемілюмінесценція (ХЛ) у біологічних системах – це низько інтенсивне світіння, що супроводжує біохімічні реакції за участю вільних радикалів. ХЛ вивчають в розчинах або суспензіях клітин і на цілих органах у складі організму, її дослідження є важливим для медичної науки і практики.

В організмі людини і тварин головним джерелом АФК є клітини-фагоцити. Для боротьби з чужорідними клітинами вони утворюють ряд АФК, які можуть взаємодіяти одна з одною і з іншими молекулами з випусканням квантів ХЛ. В основі розвитку ряду патологічних станів (запалення, гіпоксичного пошкодження, атеросклерозу, інтоксикації) та основних хвороб людини і тварин (нейродегенеративних, серцево-судинних, гормональних порушень, імунних захворювань та ін.) лежить окислювальний стрес. Тому завдяки своїй простоті, низькій вартості, високій чутливості і селективності ХЛ стала корисним інструментом дослідження в рідинній хроматографії. Розроблено багато аналітичних методів для клінічного, фармацевтичного, екологічного та продовольчого аналізу як при прямому окисленні, так і з застосуванням речовин, що активують люмінесценцію.

Методи ХЛ імунного аналізу дозволяють визначати біологічно-важливі низькомолекулярні сполуки в тих концентраціях, в яких вони наявні в біологічних об'єктах, тому вони застосовуються для виявлення гормонів, алергенів, наркотичних речовин, нуклеїнових кислот, антигенів і антитіл при вірусних та соматичних захворюваннях та ін. Зокрема, метод використовується для виявлення серологічних маркерів інфікування вірусами гепатитів В і А. Різні автоматизовані ХЛ імуноферментні аналізатори для виявлення антитіл до вірусу гепатиту С в даний час наявні у багатьох клінічних лабораторіях, вони характеризуються відмінною відтворюваністю і високою клінічною чутливістю.

В патогенезі цукрового діабету 2 типу у поєднанні з псоріазом важливу роль відіграють порушення нативної конформації білків плазми крові. Ці порушення, зареєстровані ХЛ методами, інформують про вираженість патологічного процесу, тому ХЛ тестами можна уточнити ступінь важкості захворювання та контролювати ефективність терапії.

Оксид азоту (NO) є вільним радикалом, який бере участь у багатьох фізіологічних процесах. Фізіологічні концентрації оксиду азоту вкрай низькі, в деяких випадках субнаномолярні. Для таких вимірювань розроблений високочутливий ХЛ підхід виявлення NO у водних розчинах з використанням природного оксиду азоту. При цьому швидкість реакцій, що відбуваються, збільшується приблизно в 200 разів і так забезпечується виявлення окису азоту. ХЛ виникає шляхом перетворення неорганічного пірофосфату в АТФ з допомогою АТФ сульфурилази з подальшим випромінюванням світла з АТФ, яке залежить від реакції люциферин - люцифераза. Метод дозволяє вимірювання NO в діапазоні наномолярних концентрацій і у випадку утворення NO в кількості 100 мкМ / хв.

ХЛ імуноферментний аналіз застосовується для екологічного моніторингу, клінічної діагностики, безпеки харчових продуктів і фармацевтичного аналізу, як перспективний підхід до вибіркового, чутливого, швидкого і простого аналізу.

Запропоновано ХЛ спосіб кількісного визначення утворення NO в клітинних культурах. Чутливість методу близько 50 пМ / хв, що дозволяє реєстрацію NO в кількості 10²-10⁴ клітин [2]. Вимірювали NO, що генерується активованими макрофагами мишей і ендотеліальними клітинами бичачої аорти.

ХЛ традиційно використовується для вивчення природи окислювальних бактерицидних механізмів нейтрофілів і моноцитів, власних дефектів аномально функціонуючих нейтрофілів або моноцитів і активації клітин, в імуноаналізі, блоттингу білків, вивченні токсикологічних процесів (напр., під впливом антибіотиків або імуномодуляторів). Перспективним є застосування ХЛ в клінічній імунології при вивченні аутоімунних захворювань, запальних реакцій, ендокринних розладів, імунодефіцитних станів, імунної відповіді слизової оболонки на наркотики і патогени, на пухлини та інфекції.

У хворих хронічним риносинуситом дослідження особливостей функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів виявили збільшення швидкості утворення АФК як при спонтанній, так і при зимозан-індукованій хемілюмінесцентній реакції.

ХЛ метод використовувався для визначення відносного внеску різних типів клітин в промитих сперматозоїдах у загальну внутрішньоклітинну величину продукції Н₂О₂ і пероксинітриту. Кожен тип клітин в спермі давав різний внесок у внутрішньоклітинний рівень H₂O₂ і пероксинітриту.

У хворих періодичною хворобою (ПХ) вивчали інтенсивність ХЛ і показники вільнорадикального перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) сироватки крові за допомогою спонтанної і індукованої ХЛ та визначали продукти ПОЛ. При підвищенні температури інтенсивність спонтанної ХЛ зростала і помітно збільшувалася під час нападу. Тому різка зміна інтенсивності ХЛ і показників ПОЛ може відображати розвиток патологічного процесу при ПХ.

Динамічне визначення інтенсивності перекисіндукованої ХЛ сироватки крові у хворих на опіоїдну залежність, сполучену із хронічним гепатитом С, у різні періоди хвороби дало можливість встановити, що динаміка інтенсивності спонтанної та активованої ХЛ вказує на активацію процесів перекисного окислення ліпідів, зростання вмісту прооксидантних речовин, зменшення буферної антиоксидантної ємності сироватки крові у хворих на опіоїдну залежність у пізньому абстинентному періоді.

Набув розвитку новий аналітичний інструмент, що комбінує імунологічні (антитіла) і ХЛ методи, який був названий ХЛ імуноферментним аналізом. В лабораторіях метод був протестований для вивчення різних пухлинних уражень від залозистої тканини до передміхурової залози і щитовидної залози.

ХЛ методи широко застосовуються для аналізу харчових продуктів: для визначення азотовмісних компонентів, цукру, хімічних консервантів, металів, гормональних анаболіків і метаболітів та ін. Проведені дослідження щодо вивчення можливості використання ХЛ для оцінки антиоксидантної активності харчових речовин показали, що за допомогою ХЛ можна визначати кількість пероксидів в дуже сильно розбавлених системах, що важливо для оцінки початку окислення продуктів, наприклад, в процесі їх зберігання.

Ознаки порушення екологічного гомеостазу вимагають проведення досліджень з біологічного моніторингу середовища. Встановлюючи реакцію ссавців на комплексний вплив хімічних забруднювачів навколишнього середовища провели порівняльний аналіз показників ХЛ крові кроликів, що знаходяться в міському середовищі і сільській місцевості, де відсутні промислові та переробні підприємства, немає фермерських господарств, городництво ведеться населенням без використання отрутохімікатів. Зведені показники ініційованої ХЛ АФК процесу фагоцитозу без стимуляції і зі стимуляцією вказували на ослаблення клітинного імунітету у тварин, яких утримували в міських умовах. За даними ХЛ перекисного окислення ліпідів в еритроцитах і сироватці крові у тварин, яких утримували в міському середовищі, виявлено більш високий рівень вільнорадикального окислення ліпідів.

Методи ХЛ імуноферментного аналізу є швидкими, з високою пропускною здатністю, чутливими і дешевими, що передбачає їх подальший розвиток для потреб біології та медицини як з науковою метою, так і з метою діагностики та контролю ефективності терапії в клінічній практиці [1].

Література

1.Wang. C. Chemiluminescent Immunoassay and its Applications / C. Wang, J. Wu, C. Zong [et al.] // Chinese Journal of Analytical Chemistry. – 2012. – V. 40, Issue 1. – P.3-10.

2. Woldman Y.Y. Detection of nitric oxide production in cell cultures by luciferin-luciferase chemiluminescence/ Y.Y.Woldman, T.D. Eubank, A.J. Mock // Biochem Biophys Res Commun. – 2015. - Sep 18; 465(2):232-8