Рыжов К.А., Носик М.Н., Никифорова М.А.

Перспективы диагностики ВИЧ-инфекции с помощью микрочипов

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, Россия

Для улучшения качества жизни ВИЧ-инфицированного требуется проведение высокоактивной антиретровирусной терапии, которая должна проводиться пациенту пожизненно. Однако проведение терапии быстро становится неэффективной в связи с быстрой выработкой резистентности к антиретровирусным препаратам (АРВП) из-за высокой степени генетической изменчивости вируса [2,4,5]. Поэтому одной из самых важных задач при диагностике ВИЧ является быстрое выявление вируса и своевременное выявление устойчивых к АРВП вариантов вируса. Эта задача выполнима при диагностике ВИЧ с помощью методов, основанных на исследовании генетического материала.

В настоящее время в России зарегистрирована и разрешена к применению только одна тест-система для определения мутаций устойчивости ВИЧ: ViroSeq HIV-1 фирмы Abbott. Однако ее применение сильно ограничено необходимостью приобретения дорогостоящего оборудования и реактивов. В последнее время все более широкое распространение в диагностике заболеваний различной природы получают методы, основанные на технологии микрочипов [1-3]. Сущность метода заключается в амплификации генетического материала, последующей гибридизации с набором зондов и выявлением флуоресцентным или колориметрическим методом образовавшихся дуплексов. Теоретически с помощью этого метода в одной пробе можно выявить все известные мутации устойчивости к АРВП в одной реакции. Тест-система для выявления точечных мутаций ВИЧ, основанная на этой технологии может стать альтернативной методу сиквенирования.

Целью настоящего исследования было разработать тест-систему для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью ВИЧ, на основе твердофазного гибридизационного анализа с колориметрическим выявлением продуктов гибридизации. Точкой различия наиболее распространенных в России субтипов А, В и gagA/envB является область, расположенная в гене pol. В этой области расположено множество мутаций устойчивости ко многим широко применяемым АРВП. Поэтому именно эта область была выбрана для проведения исследований.

Для использования метода микрочипов необходимо иметь набор из 4-х – 6-ти нуклеотидных зондов для каждой мутации, отличающихся на один нуклеотид, в позиции мутации. Правила подбора зондов такие же, как и для подбора праймеров для проведения ПЦР. Однако особое внимание надо обратить на то, чтобы зонд не попал в высоковариабельную область генома, чтобы искомый нуклеотид находился в середине зонда и чтобы зонды не перекрывались друг с другом.

Однако при исследовании расположения мутаций в геноме ВИЧ видно, что расстояние между некоторыми мутациями устойчивости к АРВП составляет 1 – 3 нуклеотида, например пары Т69I – K70R и K65R – D67N. Это обстоятельство не позволяет выявлять данные мутации с помощью зондов. Из базы данных по мутациям устойчивости видно, что набор мутаций различается для разных субтипов, поэтому при создании панели зондов необходимо учитывать эту разницу. Создание такой альтернативной сиквенированию системы перспективно, поскольку отнимает меньше времени при анализе при меньших затратах, но наталкивается на трудности, связанные с подбором зондов и высокой генетической изменчивостью ВИЧ.

Учитывая все вышеперечисленные условия, нами был создан вариант тест-системы для выявления точечных мутаций в геноме ВИЧ 3-х субтипов, циркулирующих на территории РФ (A, gagA/envB, B), на полистироловых 384-х луночных планшетах с использованием олигонуклеотидных зондов.

С помощью разработанного опытного образца тест-системы на лекарственную устойчивость было проанализировано 29 образцов от ВИЧ-инфицированных лиц, проживающих в Москве и Московской области. Из них 10 образцов от лиц, не получавших антиретровирусную терапию (АРВ-терапия) и 19 образцов от лиц, которые проходили АРВ-терапию. В образцах от пациентов, не получавших АРВ терапию, не были выявлены мутации, вызывающие резистентность к лекарственным препаратам. У 6 пациентов, проходящих АРВ-терапию (32%), были выявлены мутации, вызывающие резистентность к антиретровирусным препаратам (АРВП). У пациента, не получавшего АРВ терапию, выявлялся тип, генетическая последовательность которого была полностью идентична консенсусной («дикий» тип) и присутствовала мутация M41G, не приводящая к появлению резистентности к АРВП. У пациентов, проходивших лечение, выявлялся как «дикий» тип, так и мутации Q151M и M41L, вызывающие устойчивость к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ) AZT и d4T. Надо отметить, что мутации в данной позиции могут вызывать перекрестную резистентность и к другим препаратам. Так мутация M41L к AZT вызывает резистентность к препаратам ABC, ddI, TDF, и d4T, а мутация Q151M к d4T вызывает резистентность к препаратам 3TC, FTC, ABC, ddI, TDF, и AZT.

Литература

1. Грядунов Д.А., Зименков Д.В., Михайлович В.М. и др. // Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике.// Лаборатория – 2009. т.3 (11) – с. 10-14.

2. Кравченко А.В., Беляева В.В., Ситдыкова Ю.Р. и соавт.//Факторы, определяющие эффективность высокоактивной антиретровирусной терапии у больных ВИЧ-инфекцией//Эпидемиология и инфекционные болезни, 2005.- №5.- С.53-58.

3. Мызникова А.И., Захарова Н.В., Грядунов Д.А. и др. // Олигонуклеотидный микрочип для одновременной идентификации шести возбудителей различной природы. // Вопросы практической педиатрии. – 2009. т.4 (1) – с. 35-38.

4. Gianella S., Richman D.D. Minority Variants of drug-resistant HIV // J. Infect. Dis. – 2010. – Vol.202. – P. 657-666.

5. Hirsch M.S., Gunthard H.F., Schapiro J.M et al.// Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008 recommendations of an international AIDS society-USA panel // Clin. Infect. Dis. – 2008. – Vol. 47. – P. 266-285.