Медицина / 7.Клиническая медицина.

К. мед. н. Прийма О. Б.

Трускавецька міська лікарня МОЗ України,

Дрогобицький державний педагогічний університет імені Івана Франка

Зміна вмісту неферментних катіонних білків та ступеня пошкодження лейкоцитів у кролів при крововтраті

 

Выполнены цитохимические исследования содержания неферментных катионных белков (НКБ) в лейкоцитах у кроликов при острой кровопотере с определением среднего цитохимического коэффициента (СЦК) и степени повреждения лейкоцитов. При умеренной кровопотере содержание НКБ было повышено на протяжении двух недель. В случае повторной значительной по объему кровопотере данный показатель резко уменьшался. Особенно существенными были эти изменения у погибших животных. При анатомо-гистологическом исследовании обнаруже­ны обширные зоны воспалительных и некротических процессов в брюшине, печени, почках, селезёнке, лёгких, сердце. У всех животных наблюдалось увеличение степени повреждения лейкоцитов, но особенно выражено это было у животных, перенесших повторное кровопуска­ние. Характер изменения СЦК и результаты анатомо-гистологических исследований погибших животных делают возможным предположить участие НКБ в развитии воспалительных и прогрессировании некротических процессов во внутренних органах кроликов, перенесших повторную острую кровопотерю. Выраженное повышение степени повреждения лейкоцитов при повторной острой кровопотере свидетельствуют о наличии в периферической крови экспериментальных животных возросшего количества нейтрофилов с голокринным типом секреции.

С лечебной целью при острой кровопотере для минимизации цитопатических изменений соматических клеток тканей и органов показана мембраностабилизирующая терапия с применением витаминов А и Е, глюкокортикоидов (преднизолон, дексаметазон), а для нейтрализации и инактивации избытка НКБ в плазме крови показано внутривенное введение 30% раствора натрия тиосульфата. Исходя из химической структуры и мембраностабилизирующего действия формальдегида показано его применение внутривенным введением в низких концентрациях 0,1-0,3% с целью лечения интоксикации и для  цитопротекции.

Вступ. Неферментні катіонні білки (НКБ) містять­ся в специфічних і азурофільних гранулах лізосом зернистих, в основному, нейтрофільних лейкоцитів (3, 4). Хімічні властивості НКБ зумовлені надлишковим позитивним зарядом через велику кількість NH2 - груп в їх моле­кулах (3, 7). Їм властивий широкий спектр фізіологічних і патофізіологічних дій. НКБ є важливим фактором неспецифічної резис­тентності організму через значний їх анти­бактеріальний потенціал (5), саме вони у разі запальних інфекційних процесів першими пошкоджують структури клітин патогенних мікроорганізмів, підготовлюючи їх до подаль­шого розщеплення (3). Неферментні катіонні білки мають виражену антикоагулянтну та антикомплементарну дію (4).

Здатність циркулюючих у крові НКБ у малих концентраціях стимулювати, а в знач­них пригнічувати процеси обміну в клітині дає змогу віднести їх до регуляторів життє­вих функцій клітин організму. Останнє ра­зом зі спроможністю підвищувати проникність клітинних і судинних мембран, а також сти­мулювати позитивний хемотаксис лейкоцитів дає можливість віднести НКБ до медіаторів запалення (5). Експериментальні дані свідчать про здатність НКБ проявляти пошкоджуючу дію стосовно соматичних клітин організму при розвитку в ньому інфекційно-запального про­цесу (3). Отже, є можливість перетворення НКБ з фактора антибактеріального захисту в фактор патогенезу запальних і деструктив­них процесів в організмі (6).

Виділення НКБ у загальний кровоток здійснюється, в основному, нейтрофілами, які мають усі три головні типи секреції: мерокринний, апокринний, голокринний (6). По­ряд з НКБ виділяється лізоцим, лактоферин, мієлопероксидаза, нейтральні протеази (3, 4, 7). Всі вищевказані сполуки, за винятком, НКБ, є ферментами. Їм властива специфічна та вузько направлена хімічна дія в організмі. Крім цього, протеази здатні розщеплювати лише мертві тканини, не впливаючи на живі, життєздатні структури. Ось чому з продуктів секреції нейтрофілів саме НКБ властива уні­версальна цитопатична дія.

Секреція НКБ з лейкоцитів у кровоток регулюється та стимулюється катехоламінами крові (6). Помірна катехоламінемія, ви­конуючи адаптаційно-трофічну функцію, призводить до активації мієлопоезу (2). При вираженій гіперкатехоламінемії спостері­гається підвищення в крові кількості акти­вованих лейкоцитів з гіперсекрецією деяких біологічно активних речовин за голокринним типом (6, 8). Особливо це проявляється за умов розвитку запального процесу в ор­ганізмі (8).

Таким чином, НКБ – важливий фактор антибактеріального захисту організму. При вираженій гіперкатехоламінемії активовані лейкоцити виділяють у кровоток значну кіль­кість НКБ, які здатні проявляти цитопатичну дію.

Метою нашої роботи було вивчення змін вмісту НКБ у лейкоцитах і ступеня їх по­шкодження при крововтраті.

Методика. У кролів обох статей віком 1-3 роки, масою 1500-3100 г моделювали гостру крововтрату кровопусканням зі стегнових судин під місце­вим знеболенням з використанням 0,25%-го розчину новокаїну. Проведено дві серії дос­лідів: у першій (20 кролів) – кровопускання одноразове, що склало 10% від об'єму цир­кулюючої крові (ОЦК); у другій (10 кролів) – дворазове кровопускання: спо­чатку 10% ОЦК, а на 3-тю добу повторна крововтрата – 15% ОЦК, так, що загальний об’єм крововтрати близько 25% ОЦК

Контрольні дослідження виконували пре­паруванням судин стегна з їх перев'язкою без кровопускання. Об'єм крововтрати виз­начали мірним циліндром та зважуванням використаних марлевих тампонів. Для досл­ідження брали кров з крайової вени вуха кроля в терміни: до початку дослідження, через 1, 2, 7, 10, 14 діб після кровопускання.

НКБ у лейкоцитах аналізували цитохімічним методом (3) з визначенням напівкількісного показника – середнього цитохімічного коефіцієнта (СЦК) за формулою Астальді-Верга.

Паралельно проводили визначення сту­пеня пошкодження лейкоцитів (3). Підрахо­вували число лейкоцитів, зафарбованих міц­ним зеленим та азуром А, у яких виявлено порушення цілісності плазматичної мембра­ни, серед 100 таких, котрі були досліджені щодо вмісту НКБ.

Проведено статистичну обробку резуль­татів з використанням критерію t Стьюдента.

Результати та їх обговорення. З першої доби постгеморагічного періоду вміст НКБ у лейкоцитах кролів першої серії дос­лідів був в 1,2-1,5 раза вищим від вихідних значень. Протягом двох тижнів СЦК набу­вав значень вищих від вихідних, але не до­сягав їх. При мікроскопії препа­ратів крові, взятих під час експерименту і зафарбованих міцним зеленим і азуром А, виявлено велику кількість нейтрофілів, ци­топлазма яких містила від десяти до тридця­ти та більше гранул і була забарвлена в інтен­сивно зелений колір міцним зеленим, про­тягом двох тижнів досліду. Ядра нейтрофілоцитів були забарвлені азуром А в світло-фіолетовий колір. Ступінь пошкодження лей­коцитів був в 2 – 4 рази вищим від вихідних значень протягом усього досліду, досягаючи максимуму на 2-гу добу постгеморагічного періоду. При мікроскопії препаратів крові, які досліджувалися щодо вмісту НКБ виявлено підвищення кількості деструктив­них, пустотілих нейтрофілів зі зруйнованими плазматичними мембранами і явищами карі­олізису протягом двох тижнів експери­менту.

У другій серії до повторного кровопус­кання СЦК і ступінь пошкодження лейко­цитів змінювалися аналогічно першій серії дослідів. Але після повторної крововтрати СЦК різко знижувався, був в 4 рази нижчим від вихідних значень, що свідчить про змен­шення вмісту НКБ у лейкоцитах, через вихід НКБ у загальний кровотік. При мікроскопії препаратів крові взятих після повторного кровопускання та зафарбованих міцним зеленим і азуром А виявлено, що ци­топлазма нейтрофілів здебільшого забарвле­на в блідо-зелений колір і містить кілька слабо забарвлених гранул або взагалі не містить таких. Ядра нейтрофілоцитів зафарбувалися в блідо-фіолетовий колір. Ступінь пошкод­ження лейкоцитів після повторної крововтрати був в 3 – 5 раз вищим від вихідних значень. При мікроскопії препаратів крові, взятих після повторного кровопускан­ня, виявлено значне підвищення кількості деструктивних, пустотілих нейтрофілів зі зруйнованими плазматичними мембранами і явищами каріолізису. В другій серії дослідів загинуло 8 тварин. Смерть настала на 10 – 14-ту добу досліду. При аутопсії виявлено потовщення, матовість і дряблість очеревини. Печінка – малокровна, на розрізі просякнута інтерстиціальною рідиною, зі стертими кон­турами структур. Аналогічні зміни виявлено в нирках, легенях, селезінці, серці. Вміст НКБ у лейкоцитах цих тварин перед смертю був в 5 раз нижчим за вихідні значення. Вод­ночас ступінь пошкодження лейкоцитів у цих же кролів був в 5,5 раза вищим за вихідні результати.

У контрольних дослідах СЦК підвищу­вався в першу добу після крововтрати, але на 2-гу добу вміст НКБ у лейкоцитах змен­шувався, нормалізуючись на 7-му добу досл­іду. У контролі в мазках крові першої доби постгеморагічного періоду підви­щувалася помірно кількість нейтрофілів, ци­топлазма яких була інтенсивно забарвлена в зелений колір і містила велику кількість гранул. Але в препаратах крові другої доби постгеморагічного періоду збільшилося число нейтрофілів з блідо-зеленим забарвленням цитоплазми. В кінці першого тижня дослід­жень у препаратах крові спостерігалася кар­тина подібна до початку експерименту. Ядра нейтрофілоцитів забарвлювались у блідо-фіо­летовий колір. Ступінь пошкодження лейко­цитів у контролі змінювався, але результати були не достовірними. При мікроскопії в контрольних дослідженнях пре­паратів крові, які вивчалися щодо вмісту НКБ, кількість деструктивних нейтрофілів була як до початку експерименту. Всі інші наведені результати є статистично достовір­ними.

Характер змін вмісту НКБ у лейкоци­тах кролів, що перенесли кровопускання, може бути виявом фізіологічних адаптацій­них реакцій, які розвиваються у відповідь на подразники різної сили (1, 8).

Так, одноразову гостру крововтрату (10% ОЦК) у кролів першої серії проведених дос­ліджень можна вважати подразником серед­ньої сили дії. В результаті розвивається по­мірна гіперкатехоламінемія, яка виконує при цьому адаптаційно-трофічну функцію, кот­ра полягає у стимуляції мієлопоезу (2). У цьому разі вміст неферментних катіонних білків у лейкоцитах збільшується, за рахунок викидання в кровоток з кісткового мозку пулу нейтрофілів багатих НКБ, а ступінь пошкодження лейкоцитів в перші доби постгеморагічного періоду також збільшується, але помірно і нормалізується до 14-ї доби. Такі зміни з боку лейкоцитів можуть бути виявом реакції активації, яка є неспецифіч­ною основою фізіологічних процесів, скеро­ваних на підвищення загальної опірності ор­ганізму та є необхідною для профілактики запальних процесів у експериментальних тва­рин, що перенесли кровопускання.

Повторна значна за об'ємом крововтра­та, як надзвичайний подразник, є неспециф­ічною основою виникнення патологічних про­цесів (1). Виявом цього є зменшення вмісту НКБ у лейкоцитах і значне підвищення сту­пеня пошкодження лейкоцитів в крові кролів, що перенесли дворазову крововтрату в кількості 25% ОЦК у другій серії досліджень. Гостра крововтрата, як неінфекційний стрес, супроводиться гіперкатехоламінемією (2). Ос­тання стимулює підвищену секрецію НКБ з нейтрофілів (6). Наявність в периферичній крові великої кількості нейтрофілів зі зруй­нованими плазматичними мембранами і яви­щами каріолізису може бути проявом збіль­шення кількості зернистих лейкоцитів з голокринним типом секреції, при якій з ос­танніх “лавиноподібно” виділяється велика кількість НКБ та інших чинників, що містять­ся в лізосомальних гранулах поліморфноядерних лейкоцитів.

Циркулюючи в кровотоку НКБ, маючи цитопатичний ефект, здатні пошкоджувати со­матичні клітини організму. Це сприяє поши­ренню зон некрозів у внутрішніх органах кролів поряд з такими, викликаними гострою ішемією тканин через крововтрату. Здатність НКБ під­вищувати проникність клітинних і судинних мембран поряд зі стимуляцією позитивного хе­мотаксису лейкоцитів може бути підтверджен­ням участі НКБ у розвитку запальних про­цесів у внутрішніх органах кролів, що перенесли повторну значну гостру крововтрату.

Отже, помірна гостра крововтрата у кро­лів призводить до підвищення середнього вмісту НКБ у циркулюючих нейтрофільних лейкоцитах, що надає останнім високого ан­тибактеріального потенціалу і підвищує цим самим загальну опірність організму. Повтор­на значна за об'ємом гостра крововтрата у кролів спричинює підвищення в кровотоку кількості нейтрофілів з голокринним типом секреції та “лавиноподібного” виходу НКБ з лейкоцитів у кровоток. Внаслідок цього, цир­кулюючи в кровотоку, НКБ можуть поширювати зони некрозів і викликати розвиток запальних процесів у внутрішніх органах експериментальних тварин, що перенесли пов­торну гостру значну крововтрату.

Щодо механізму цитопатичної дії, котрий лежить в основі некротичних і запальних процесів у тканинах і органах анемізованих організмів, то найбільш ймовірним видається електростатичний механізм взаємодії НКБ, котрі мають надлишковий позитивний заряд; з негативно зарядженими компонентами рецепторів цитоплазматичних мембран. Блокування клітинних рецепторів веде організм до стану близького до анабіозу. Тривале у часі існування останнього є небезпечним для організмів високоорганізованих тварин, таких як ссавці, і веде до некротичних, а відтак і запальних процесів в тканинах і органах організмів, що перенесли гостру профузну крововтрату.

Для запобігання ушкодженню цитоплазматичних мембран соматичних клітин необхідна мембран стабілізуюча терапія організмів, що перенесли гостру анемізацію. Для цього застосовували вітаміни А і Е; преднізолон, дексаметазон чи інші глюкокортикоїди. З метою нейтралізації НКБ в плазмі крові анемізованих тварин показано застосування 30% розчину натрію тіосульфату.

Гіпотетично заслуговує на увагу застосування формальдегіду в низьких концентраціях 0,1-0,3% довенним введенням. Як відомо, 40% розчин формальдегіду має виражену мембранстабілізуючу дію, оскільки in vitro пригнічує процеси аутолізу в тканинах. Крім цього, хімічна структура формальдегіду, наявність вільних валентностей С  О дає можливість  молекулам формальдегіду взаємодіяти із NH2 – групам НКБ в організмі анемізованого, інактивуючи їх. Більше того, за неопублікованими даними (доц. Федущак А. Л.) показано лікувальний ефект зовнішнього застосування формальдегіду в низьких концентраціях при гангрені ноги, що дозволило зберегти кінцівки у двох лікованих хворих.

Висновки

1. У разі помірної експериментальної крово­втрати у кролів підвищується загальна опірність організму. Важлива роль у цьому на­лежить підвищеному вмісту неферментних катіонних білків у нейтрофілах, що є виявом активації мієлопоезу при гострій крововтраті.

2.    При повторній значній за об'ємом крововтраті неферментні катіонні білки, що “лавиноподібно” виділяються з нейтрофілів у кровоток, перетворюються з фактора захисту в фактор патогенезу некротичних і запальних процесів у внутрішніх органах дослідних тварин.

3.    Повторне кровопускання у кролів призводить до стимуляції голокринного типу секреції нейтрофілів у периферичному кровотоку, що може бути зумовлено гіперкатехоламінемією.

4.    З лікувальною метою показане застосування вітамінів А і Е, 30% розчину натрію тіосульфату і глюкокортикоїдів при гострій крововтраті.

Література:

1.     Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., У колова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. – Ростов-на-Дону: Изд-во Ростов, ун-та, 1990. –  224 с.

2.     Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. – М.: Медицина, 1983. – 239 с.

3.     Мазинг Ю.А. Функциональная морфология катионных белков лизосом нейтрофильных гранулоцитов. – Автореф. дисс. докт, биол. наук. – СПб, 1993. –  46 с.

4.     Нагоев Б.С. Катионный белок лейкоцитов и его значение. – Нальчик: Эльбрус, 1982. – 102 с.

5.     Пигаревский В. Е. О молекулярном уровне некоторых общепатологических процессов // Архив патологии. – 1990. – т. 52. –  № 1. –  С. 5-11.

6.     Терещенко И. П., Кашулина А. П. Роль системы нейтрофильных гранулоцитов в формировании особенностей развития патологических процессов // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 1993. – № 4. – С. 56-60.

7.     Kruse-Jarres J.D., Kinzelmann Т. Pathobiochemistry and clinical role of granulocytes ant their lisosomal neutral proteinoses in inflammatory processes // Arztl. Lab. – 1986. – 32. – P. 185-196.

8.     Lazar G. Stress: from concept to modern immunology. In: Stress of life: from molecules to man / Ed. By. P. Csermely. – Annals of the NYAS. – 1998. – 851. – P. 16-18.

 

О.В. Priyma

THE CHANGES OF THE CONTAIN OF NON - ENZYMATIC CATIONIC PROTEINS AND THE DEGREE OF DAMAGE IN LEUCOCYTES IN THE RABBITS WITH HAEMORRAGES

We study the contain of non - enzymatic cationic proteins (NCP) and the "degree of damade" in leuco­cytes in the rabbits with haemorrages. In the animals with unimportant haemorrages the contain of NCP in leucocytes increased. But in the rabbits with the considerable and return haemorrages the contain of NCP in leucocytes lossed. The degree of damage in leucocytes increased in the all experiments. The received results proved the presence of leucocytolysis in the rabbits with considerable and return haemorrages. In the rabbits with haemorrages the contain of NCP in leucocytes changed dependence of the weight of the haemorrages.