Биологические науки. Структурная ботаника и биохимия растений.

Тихомирова Л.И.

Научно-исследовательский институт садоводства Сибири имени

М.А. Лисавенко, Россия

к.б.н. Куцев М.Г., к.б.н. Т.А. Синицына

Алтайский государственный университет, Россия

Особенности морфогенеза Iris ensata Thunb. в культуре in vitro

Представители рода Iris относят в группу основных многолетников используемых в озеленении наряду с пионом, лилейником, флоксом, астильбой, тюльпаном и нарциссом. Сорта I. ensata ценят за красоту цветка, раннелетний срок цветения, декоративность листвы в течение сезона

Для получения качественного посадочного материала лаборатории биотехнологии научно – исследовательских институтов разрабатывают технологии микроклонального размножения ириса. В работе научных сотрудников Биолого-почвенный институт ДВО РАН продемонстрирована возможность размножения дальневосточных представителей I. pseudacorus L. посредством непрямой регенерации побегов в культуре ткани и применения RAPD-анализа для детектирования и контроля сомаклональной изменчивости. Сходство регенерантов с растением – донором составило 31% (Козыренко и др., 2004).

Исследование культуры ткани органов цветка видов I. ensata, I. setosa и I. saguinae показало, что возможна реализация разных путей морфогенеза: органогенез через прямое образование побегов из эксплантов и флоральный органогенез в каллусной культуре для I. ensata (Болтенков, 2002).

Цель нашей работы - выявление особенностей морфогенеза в культуре ткани органов цветка при микроклональном размножении сортов и гибридов I. ensata и получение регенерантов идентичных материнским растениям.

Материалы и методы

Объекты исследований – перспективные сорта и новые элитные гибриды I. ensata селекции НИИСС им. Лисавенко. Цветки брали в фазе бутонизации (VI - VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обёртки. Трубку околоцветника делили на фрагменты размером не более 3 × 3мм и помещали на питательные среды.

Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга (MS) содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводили фитогормоны в разных концентрациях: индолилмасляную кислоту (ИМК) и α – нафтилуксусную кислоту (НУК) 0.1, 3 -5мкМ в сочетании с 6-бензиламинопурином (БАП) 4 –8,10 - 20мкМ. рН среды доводили до 5,8-5,9 и добавляли 0,6% агара.

Выявляли регенерационную способность и пути морфогенеза, согласно существующей в настоящее время классификации путей морфогенеза (Батыгина и др., 2002).

Был проведён фрагментный анализ полногеномной ДНК. Из образцов ДНК выделяли с помощью набора реагентов Diamond DNA (ООО «Алтайбиотех»), стандартизировалась по количеству ДНК разбавлением бидистиллятом после измерения концентрации с помощью флуориметра Qubit Invitrogen. Изучение полиморфизма предполагалось методом RAPD-анализа, подбор амплификации проводился из стандартных коммерческих наборов олигонуклеотидных декамерных праймеров (фирма Roth, Германия). Использовалась стандартная программа ПЦР-реакции для RAPD-метода (первичная денатурация: 95 °С – 2,5 мин; 38 циклов: 95 °С – 30 сек, 36 °С – 30 сек, 72 °С – 2 мин; конечная элонгация: 72 °С – 4 мин). При проведении ISSR использовали аналогичную программу амплификации с температурой на стадии отжига 45 °С. Продукт амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,5 агарозном геле, после окраски этидиумбромидом (5 мг/л) фотографировали на гельдокументирующей системе в проходящем УФ-свете.

Результаты исследований и их обсуждение.

В эксплантах трубки околоцветника I. ensata на питательных средах с содержанием 4-8 мкМ БАП 3-5 мкМ НУК морфогенез проходил по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования. Побеги, развившиеся de novo, имели типичное строение для однодольных растений. Отличием явилось формирование флоральных элементов вместо примордиев первых листьев. Для дальнейшей стимуляции развития побегов необходимо содержание БАП в питательных средах в пределах 10-20 мкМ, а содержание НУК - 1 мкМ (Тихомирова, 2010).

Основными показателями, определяющими эффективность размножения служат число микропобегов (пазушных и адвентивных), образовавшихся de novo в течение одного пассажа и их длина. С нашей точки зрения рассматривать каждый из этих показателей отдельно было бы не правомерно, так как чем больше число побегов образуется, тем меньше их длина и наоборот. Поэтому число побегов и их длину мы рассматриваем в совокупности и считаем факторами сопряжёнными.

При микроразмножении I. ensata использовали питательные среды, содержащие 10, 15, 17.5, 20 мкМ БАП, а также среды, содержащие такое же количество цитокинина, дополненные ауксинами 1,0 мкМ НУК и 0,1 мкМ ИМК. В качестве контроля была использована питательная среда, содержащая 1 мкм БАП. При культивировании I. ensata микропобеги выделяют в питательную среду продукты метаболизма, которые угнетают рост и развития растений. По данным Е. Болтенкова (2002) эти вещества относятся к группе флавоноидов. Для их инактивации нами были использованы L-глютамин (L-гл) и аденин сульфат (а. с.)в количестве 100 мг/л, а также поливинил пиролидон в количестве 5г/л. Также для преодоления токсического действия флавоноидов время пассажа сократили до 15-21 дня. Анализ роста и размножения микрорастений I. ensata показал, что в течение 12 пассажей средним значением числа побегов во всех вариантах опыта является 1,79 шт., а высоты растений – 49, 08 мм. Выше среднего значения были показатели на питательной среде содержащей 15 мкМ БАП + L-гл +а. с. и 15 мкМ БАП + 1мкМ НУК + 0,1мкМ ИМК.

По данным Т. Yabuya (1981, 1991) наибольшее число адвентивных побегов можно получить у I. ensata если pH среды снизить до 4,5 - 5,0. Наши опыты не подтверждают эти выводы.

При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно, наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению и в конечном итоге гибель. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Р.Г. Бутенко (1999), путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов. Для преодоления отрицательного действия цитокининов (20 мкМ БАП) у I. ensata микропобеги культивировали по схеме с чередованием сред с высокой концентрацией цитокинина и низкой. Наибольший коэффициент размножения (3,11) был получен на питательной среде с 20 мкМ БАП + 1мкМ НУК + 0,1мкМ ИМК при чередовании с 1мкМ БАП через один пассаж. При такой схеме культивирования высота побегов была также выше среднего значения (табл. 1).

Таблица -1.

Влияние концентрации гормональных и не гормональных регуляторов роста на число и высоту побегов у I. ensata гибрид № 59-66-00

БАП мкМ	показатель	MS+БАП	MS +БАП+ L-гл +а. с.	MS+БАП + п-пирол.	MS+БАП+1мкМ НУК + 0,1мкМ ИМК	MS+БАП pH 5,0
10,0	число поб.	1,83±0,13	1,8±0,27	1,75±0,15	1,75±0,57	1,6±0,32
	высота раст., мм	47,41±4,35	45,0±7,23	53,0±6,0	37,5±4,38	42,5±4,68
15,0	число поб.	1,84±0,12	2,25±0,9	1,2±0,09	1,8±0,65	-
	высота раст., мм	46,66±5,23	50,66±5,49	58,0±3,99	58,33±1,78	-
17,5	число поб.	1,5±0,22	2,0±0,36	1,66±0,04	1,25±0,19	-
	высота раст., мм	56,71±9,09	48,0±8,0	44,15±7,77	51,25±2,97	-
20,0	число поб.	-	2,0±0,4	-	2,0±0,36	-
	высота раст., мм	-	46,66±3,56	-	45,64±7,72	-
20,0 чередование сред 20,0→1,0	число поб.	-	-	-	3,11±0,45	-
	высота раст., мм	-	-	-	54,2±6,12	-
1,0 конт.	число поб.	1,2±0,19	-	-	-	-
	высота раст., мм	42,85±7,72	-	-	-	-
Примечание: 1) L-гл +а. с. - L-глютамин и аденин сульфат в количестве 100 мг/л, 2) п-пирол. - поливинил пиролидон в количестве 5г/л., прочерк – опыт не проводился.

Для подтверждения идентичности проведён фрагментный анализ полногеномной ДНК растений – доноров и регенерантов методом RAPD и ISSR. С помощью RAPD после амплификации с праймерами серий А и В (40 шт.) в общей сложности было получено более 120 амплифицированных фрагментов, при этом не выявлено различий между материнскими растениями и регенерантами. Из отобранных предварительно ISSR- праймеров нами были использованы при проведении анализа № 17898В и № 17899А (Куцев, 2009). Предварительный анализ, проведенный в 3-х кратной повторности, показал полностью отсутствие вариабельности в геноме. Для повышения чувствительности метода продукт амплификации обработали рестриктазами EcoRI и HindIII ghb +37 °С в течение 2 часов. Полученный продукт повторно анализировали на агарозном геле. При этом также не было выявлено отличий в геномах материнских растений и полученных регенерантах.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе показана возможность клонального размножения I. ensata посредством прямой регенерации побегов в культуре ткани органов цветка. В эксплантах трубки околоцветника I. ensata на питательных средах с содержанием 4-8 мкМ БАП 3-5 мкМ НУК морфогенез проходил по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования. Побеги, развившиеся de novo, имели типичное строение для однодольных растений. Отличием явилось формирование флоральных элементов вместо примордиев первых листьев. Для дальнейшей мультипликации побегов необходимо чередовать питательные среды с высоким (20мкМ) и низким (1мкМ) содержанием фитогормонов. Время одного пассажа не должно превышать 15 – 21 дня. Данная технология позволяет получить растения-регенеранты идентичные материнским, что было подтверждено методом RAPD и ISSR.

Список литературы

1. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений. – СПб., 2002. 232 с.

2. Болтенков Е.В. Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии / Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Владивосток. 2002. 19 c.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток растений in vitro и биотехнология на их основе: Учеб. пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

4. Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Болтенков Е.В., Лауве Л.С. Сомаклональная изменчивость Iris pseudacorus L. по данным RAPD- и цитогенетического анализа // Биотехнология, 2004. №2. С. 13-23.

5. Куцев М.Г. Фрагментный анализ ДНК растений: RAPD, DAF, ISSR. - Барнаул: АRТИКА, 2009. 160 с.

6. Тихомирова Л.И. Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro // Turczaninowia, 2010. № 3 (3). С. 147-151.

7. Yabuya T, Ikeda Y., Adachi T. In vitro propagation of japanese garden iris - Iris ensata Thunb. //Euphytica. 1991. Vol. 57. P. 77-82.

8. Yabuya T., Yavagata. Embryo growth and Cultural Condition in Iris ensata thumb. // Japan J. Breed. 1981. Vol.31 (4). P. 377-382.

Реферат

Продемонстрирована возможность клонального размножения сортов и гибридов I. ensata методом прямой регенерации побегов в культуре ткани органов цветка. Методом RAPD и ISSR-анализа полногеномной ДНК не выявлено никаких отличий в геноме между материнскими экземплярами полученными от них растениями – регенерантами.