К.ф.н. Струсовская О.Г., к.б.н. Лисишникова Л.П.
Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск,
Россия
Исследование антимикробной
активности концентрата хлорофиллов из Laminaria saccharina (Laminariaceae L.)
Поиск эффективных антимикробных,
ранозаживляющих средств с низким уровнем риска возникновения нежелательных
эффектов для лечения ожоговых ран остается актуальной проблемой фармации.
Известно, что хлорофилл обладает противомикробными свойствами, поэтому целью
настоящей работы являлось изучение антибактериальной активности концентрата
хлорофиллов, полученного из воздушно-сухого сырья Laminaria saccharina (Laminariaceae L.),
произрастающей в акватории Белого моря в прибрежной зоне островов Соловецкого
архипелага. Сумму хлорофиллов получали исчерпывающей экстракцией измельченного
воздушно-сухого сырья Laminaria saccharina. С этой целью
воздушно-сухое сырье измельчали до размера частиц, проходящих через сито с
диаметром отверстий 0,5 мм, добавляли спирт этиловый 96% в соотношении 10:1. Процесс
экстрагирования проводили в плотно укупоренных сосудах при 20ºС в
защищенном от света месте в течении четырех часов при периодическом
перемешивании смеси. Полученный экстракт декантировали. К растительному сырью
добавляли новую порцию экстрагента. Процесс повторяли трижды. После последней
экстракции растительный остаток отжимали, пропуская через ватно-марлевый пресс.
Полученные органические извлечения объединяли и отгоняли растворитель под
вакуумом при 30º С в защищенном от света месте. К полученному остатку
добавляли воду очищенную (ФС 42-2619-97) (вода) в соотношении 1:10 и
образовавшуюся смесь фильтровали через бумажный фильтр «Синяя лента» (ТУ
6-09-13-493-76), тем самым очищая экстракт от водорастворимых примесей. Остаток
на фильтре промывали еще двумя порциями воды и растворяли в спирте этиловом 96%
в соотношении 1:0,5. Концентрацию суммы
хлорофиллов в экстракте определяли методом УФ-спектрофотометрии в кварцевых
кюветах с толщиной слоя 1 см относительно растворителя в области 200 нм – 700
нм с шагом дискретизации 1 нм (рис.1). Контроль деструкции хлорофиллов проводили,
рассчитывая значение отношений оптической плотности при 415 нм к значению оптической
плотности раствора при 670 нм (А415/А670), которое не превышало значения 2,2 /1/. Концентрацию суммы хлорофиллов рассчитывали
по формулам:
где
Хл.а – концентрация хлорофилла а, (мг/л);
Хл.с1
+ с2 - концентрация суммы хлорофиллов с1 и с2 (мг/л);
А
– оптическая плотность раствора при определенной длине волны;
11,85;
1,54; 24,52; 7,60; 2,13; 209 – коэффициенты, учитывающие взаимное поглощение
при совместном присутствии хлорофиллов а и с, рассчитанные экспериментально /2/.
С целью увеличения стабильности
хлорофиллов к экстракту добавляли стерилизованное оливковое масло до получения
25% концентрации суммы хлорофиллов, остаток спирта этилового 96% отгоняли под
вакуумом. Так как растительные масла содержат хлорофиллы а и b, полученную концентрацию действующих веществ определяли
спектрофотометрически. С этой целью готовили раствор масляного концентрата
в ацетоне (ЧДА, ГОСТ 2603-79) и измеряли оптическую плотность полученного раствора в
области 200 нм - 700 нм относительно растворителя с шагом дискретизации 1 нм. Содержание
суммы хлорофиллов рассчитывали по формулам, учитывающим одновременное
присутствие хлорофиллов а, b и с /3/:
где Хл.а – концентрация
хлорофилла а, (мг/л);
Хл.в
– концентрация хлорофилла в, (мг/л);
Хл.с - концентрация
суммы хлорофиллов с1 и с2
(мг/л);
А
– оптическая плотность раствора при определенной длине волны.
С целью определения
оптимальной концентрации, обеспечивающей антибактериальный эффект, проводили
микробиологические исследования в опытах in vitro на
примере динамики ингибиции роста S.aureus, так как при
бактериологическом исследовании отделяемого из патологических очагов,
локализующихся на коже, золотистый стафилококк в монокультуре выделяется в
79,9-90,8 /4/. Из тестовых культур
свежевыделенного при
гнойно-воспалительном процессе S. аureus и штамма S.aureus АТСС 25923 (США) готовили инокулюм - бактериальную
взвесь стафилококка на стерильном
физиологическом растворе и доводили до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5х108
КОЕ/мл). Стерильной пипеткой
переносили стандартную взвесь
микроорганизма в количестве 0.1 мл в
пробирки, содержащие одинаковое количество (0,1 мл) масляного концентрата
хлорофиллов с концентрациями: 0,05%, 0,10%, 0,15%, 0,20%, 0,25%, 0,30%, 0,35%,
0,40%, 0,45% и 0,5%. Пробирки интенсивно встряхивали в течении 30 сек. Инокуляцию
проводили в момент приготовления
инокулюма (взвесь № 1), далее через 2 часа (взвесь № 2), 4 часа (взвесь № 3), 6
часов (взвесь № 4), и 24 часа (взвесь №
5), в чашки Петри на твердую питательную среду - 5% кровяной
агар. С помощью микропипетки наносили
0,1 мл взвеси микроорганизма с
масляным концентратом хлорофиллов на поверхность питательной среды и равномерно
распределяли стерильным шпателем. Инкубировали при температуре 37о С в течении 20-24 часов. После инкубации определяли интенсивность роста
S.aureus. В ходе
проведенных исследований было установлено, что
оптимальная концентрация, масляного концентрата хлорофиллов составляет
0,25%, которая обеспечивает антимикробную активность в течение 24 часов (рис.2).
Таким образом, нами был получен концентрат
хлорофиллов из Laminaria saccharina (Laminariaceae) и установлена его
антибактериальная активность в отношении S. aureus.
Концентрат может быть использован для создания наружных лекарственных форм с
антибактериальным действием и низким порогом возникновения аллергических
реакций.
Рис.1
Спектр концентрата хлорофиллов из Laminaria saccarina (Laminariaceae L.)
в спирте этиловом 96%
Рис. 2
Определение антимикробной активности масляного концентрата
хлорофиллов различной концентрации на примере динамики ингибиции роста S.aureus
1 4 2 3 5
концентрация суммы хлорофиллов:
1 - 0,05%; 2 - 0,10%; 3 - 0,15%; 4 - 0,20%; 5 - 0,25%
Рис. 3
Подавление роста и размножения
S. аureus после инкубирования посевов инокулюмов при
37º С в течение 24 часов
|
1 |
3 |
|
2 |
4 |
Инокулюмы масляного концентрата
хлорофилла, содержащие 25% действующего вещества, выдержанные при комнатной
температуре в течение:
1.
двух часов; 3.
шести часов;
2.
четырех часов; 4. суток
Литература
1.
Фомин В.В./Способ
комплексной переработки сухого сырья водорослей/ В.В. Фомин,
В.А.Вайнштейн, И.Е.Каухова, Ю.А. Лимаренко //Пат РФ, Заяв. 98107768/14.- Опубл
20.12.1999.
2.
Lichtenthaler H.K. /Chlorophylls and carotenoids,
the pigments of photosynthetic biomembranes /H.K. Lichtenthaler //J. Met.Enzym.-1987.-Vol.148.-P.350-382.
3.
Jeffrey S.W. New Spectrophotometric equations for determining chlorophylls
a, b, c1 and c2 in higher plants, algae, and natural phytoplankton
/S.W.Jeffrey, G. F. Humphrey //J. Biochem. Physiol.
Plants.-1975.-N167.-P. 191-194.
4.
Кириченко И.М.
/Современные подходы к терапии инфекционных заболеваний кожи/ И.М. Кириченко
//Ж. Consilium medicum.-
2006.- Т. 8.- №1.
Адрес для переписки:
Контактный тел.: 8-909-554-23-48 (моб.)
8-8182-24-00-80
(дом.)
Струсовская Ольга Геннадьевна, к.ф.н., доц. каф. фармации и фармакологии Северного государственного медицинского университета