К.ф-м.н. Валуева С.В., Боровикова Л.Н., Суханова Т.Е., Вылегжанина М.Э.

Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия

СЕЛЕНСОДЕРЖАЩИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ НАНОМАТЕРИАЛЫ: СИНТЕЗ И МОРФОЛОГИЯ

Свойства веществ и материалов, образованных структурными элементами с размерами в нанометровом интервале, в объемной фазе не определяются однозначно. Изменения характеристик обусловлены не только уменьшением размеров структурных элементов, но и проявлением квантовомеханических эффектов, волновой природой процессов переноса и доминирующей ролью поверхностей раздела. Управляя размерами и формой наноструктур, таким материалам можно придавать совершенно новые функциональные характеристики, резко отличающиеся от характеристик обычных материалов. Регулируемое создание наноструктур должно привести, в частности, к созданию новых биосовместимых материалов с повышенными характеристиками. Молекулярные составляющие биологических систем (белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и их биологические аналоги) являются примерами материалов, чья структура и свойства определяются в наномасштабе. Многие природные наноструктуры и наносистемы образуются при помощи биологических методов самосборки. Искусственные неорганические и органические наноматериалы могут вводиться в клетки, использоваться для диагностики (например, с помощью создания визуализируемых квантовых «точек») и применяться в качестве их активных компонентов. Перечислим некоторые перспективные применения нанотехнологий в медицине: искусственные неорганические и органические наноматериалы могут вводиться в клетки, использоваться для диагностики (например, с помощью создания визуализируемых квантовых «точек») и применяться в качестве их активных компонентов; новые методы введения и распределения лекарств в организме, что имело бы большое значение для повышения эффективности лечения (например, доставка препаратов к определенным местам в организме); разработка более стойких и не отторгаемых организмом искусственных тканей и органов; разработка сенсорных систем, которые могли бы сигнализировать о возникновении болезней внутри организма, что позволило бы врачам заниматься не столько лечением, сколько диагностикой и предупреждением заболеваний.

В результате самоорганизации и самосборки могут формироваться супрамолекулярные структуры различной морфологии, в частности, наноструктуры типа «ядро-оболочка». Особый интерес представляют наносистемы на основе биогенного элемента – селена. Наночастицы наноаморфного селена (нано-а-Se⁰) с размерами 3-500 нм уже используются в качестве высокочувствительных биосенсоров для иммуноанализа и хроматографически мобильных аффинных реагентов. Даже при очень низких концентрациях селена в воде (0.005-0.1%), его частицы могут адсорбировать на своей поверхности антигены и антитела. Известно, что селен, входящий в состав пищевых продуктов, оказывает антибластическое действие, а между содержанием селена во внешней среде и частотой поражения населения злокачественными опухолями существует обратно пропорциональная зависимость [1]. Известно также, что в условиях дефицита селена наблюдается развитие миокардиодистрофии, атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда и хронического гепатита различной этимологии [2,3].

В ряде работ нами было показано, что новые высокоэффективные перевязочные и шовные материалы с антимикробной, противовирусной, репаративной и имунностимулирующей активностью могут быть получены на основе наночастиц нано-а-Se⁰, стабилизированных поли-N-винилпирролидоном (ПВП) [4]. Более того, установлено, что в отличие от свободных частиц селена, частицы нано–а–Se⁰–ПВП также оказывают и противоопухолевое действие. На клетках промиелоцитарной лейкемии HL-60 было показано, что наносистемы Se⁰–ПВП и нано–а–Se⁰–БСА ингибируют клеточный рост пропорционально увеличению их концентрации, и вызывают полную гибель клеток при концентрации 200 мкМ [5].

Ранее нами было показано [6-11], что при восстановлении ионов селена в растворах полимеров протекают два процесса – образование наночастиц селена с узким унимодальным распределением по размерам и адсорбция на них макромолекул. Это сопровождается формированием органической оболочки на неорганическом ядре и приводит к снижению поверхностного натяжения, стабилизации образующихся наночастиц от их агрегации, торможению роста, а также повышению их устойчивости к окружающей среде.

С целью создания новых высокоэффективных селенсодержащих лекарственных средств нами были получены селенсодержащие биологически активные наносистемы на основе полимерных матриц различной природы в широком диапазоне варьирования массового соотношения селен:полимер ν (ν = 0.025 - 0.2) и проведено комплексное исследование методами спектрофотомерии, динамического светорассеяния (ДСР) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Селенсодержащие наносистемы получали восстановлением селенистой кислоты аскорбиновой кислотой в водной среде в присутствии полимерных стабилизаторов (ПС) различной природы: ПВП, оксиэтилцеллюлозы (ОЭЦ), поли-N,N,N,N–триметилметакрилоилоксиэтиламмоний метилсульфата (ПТМАЭМ), поли-2-акриламидо-2-метилпропансульфокислоты (ПАМС) и полиметакриловой кислоты (ПМАК). Структурные формулы и ММ ПС приведены в таблице 1. Синтез всех нанокомпозитов осуществлялся по единому принципу, описанному в работах [6-11]. Реакция проводилась в водной среде, в условиях (рН=3,3), когда согласно данным [12] селенистая кислота практически не диссоциирует. Условия проведения реакции нано–Se⁰ в растворе полимера выдерживались постоянными: при Т=293К и атмосферном давлении. Для изучения кинетики реакции формирования нанокомпозитов и структурных особенностей наносистем был выбран ряд ν (ν = 0.025; 0.05; 0.1; 0.15; 0.2, где ν - отношение массовой концентрации селена к концентрации полимера ν= c_se/c_p).

Таблица 1. Структурные формулы и ММ ПС.

ПС	Структурная формула
ПВП Mw=23×10^3	-[-CH2-CH-]n- ê N / \ О=С CH2 ê ê Н2 С — CH2
ПДМАЭМ Mw=170×10^3	СНз | -[-СН2-С-] n – | О=С-O-(СН2)2-N^+(СНз)з • СН3 SO4^–
ПАМС Mw=2,5×10^6	-[- CH2- CH-]n- ç O=C-NH-C(CH3)2-СН2- SO3^- •Н^+
ПМАК Mw=35×10^3	СНз | -[-СН2 - С-] n – | О=С-OH
ОЭЦ Mw=150×10^3	C6H7O2(ОН)3-x[(OCH2CH2)y(OH)x]

Концентрация полимеров выдерживалась постоянной во всех случаях и составляла 0,1мас.%. Восстановление селенистой кислоты H₂SeO₃ аскорбиновой кислотой C₆H₈O₆ в водной среде согласно уравнению реакции (1)

H₂SeO₃+ 2C₆H₈O₆ → Se+3H₂O+ 2 C₆H₆O₆ (1)

приводит к образованию золя нуль – валентного селена Se⁰ (в виде красно - оранжевого раствора) и дегидроаскорбиновой кислоты. Золь неустойчив в растворе и выпадает в осадок через 24 часа, а через 7 -10 суток селен из аморфной красной формы переходит в другую свою модификацию – серый металлический селен. Образованиенуль-валентного селена в результате выбранной реакции соответствует ранее проведенным работам [6-11].

Величины константы скорости k* реакции формирования нанокомпозитов были рассчитаны по методу Гуггенгейма (предложенному для реакций первого и псевдопервого порядков) по формуле k* = log(D_k/(D_k – D_i))/t_i, где D_k – оптическая плотность, характеризующая окончание процесса, D_i – оптическая плотность в данный момент времени t_i. Методом динамического светорассеяния определяли средние гидродинамические размеры наноструктур R_h^*. Радиусы эквивалентных гидродинамических сфер R_h^* рассчитывали из значений коэффицентов диффузии (D^*) по уравнению Эйнштейна – Стокса R_h^* = kT/6πη₀D^* (η₀ – вязкость растворителя). Изучение топографии поверхности тонких пленок, полученных из водных растворов ПС-нано-а-Se⁰, проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на приборе Nanotop NT-206 («Микротестмашины», Беларусь). Каплю раствора наносили на покровное стекло и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Измерения проводили в контактном режиме в атмосферных условиях с использованием кремниевых кантилеверов NSG 01. Обработка экспериментальных данных производилась с помощью программы Surface View 1.0.

Известно, что синтез наносистем – сложный процесс, зависящий от многих параметров, в том числе, молекулярной массы ПС, структуры мономерного звена, жесткости полимерной цепи, наличия и знака заряда. Поэтому, необходимо учитывать всю совокупность характеристик ПС, которые будут играть различную по значимости роль на разных стадиях процессов формирования и самоорганизации наносистемы. В таблице 2 приведены значения константы скорости процесса самоорганизации селенсодержащих наносистем k^* для различных ПС при варьировании ν. Видно, что в области ν = 0.05 и ν > 0.1 наблюдается увеличение значений параметра k* в следующей последовательности: ПТМАЭМ (поликатион) ≤ неионогенные полимеры < ПАМС (полианион). Таким образом, знак заряда на макромолекулах ПС играет определяющую роль в исследуемом процессе.

Следует отметить, что при соотношении компонентов ν = 0.1 параметр k* возрастает в ряду: ПМАК< ПТМАЭМ < ПВП < ПАМС < ОЭЦ. То есть, в данном случае влияние зарядовых характеристик на величину k* нивелируется совокупностью других выше указанных параметров.

Таблица 2. Константы скорости процесса самоорганизации селенсодержащих наносистем k^* и гидродинамические радиусы R_h^* образующихся наноструктур для различных ПС при варьировании ν.

ν	k^*×10^3,c^-1					Rh^*, нм
	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
0.025	0.73	0.47	0.36	0.3	0.5	9	55	95	173	70
0.05	0.92	0.48	1.14	0.8	0.5	10	45	80	147	75
0.1	1.38	0.54	1.83	3.7	0.4	57	70	90	147	90
0.15	1.42	2.48	4.33	4.0	2.3	57	60	60	136	65
0.2	1.48	1.28	7.63	5.4	3.7	57	40	45	138	60

Обозначения: 1-ПВП; 2-ПТМАЭМ; 3-ПАМС; 4-ОЭЦ; 5-ПМАК

Сравнение зависимостей R^*_h = f(ν) для ПВП и ПТМАЭМ (рис. 2) показывает, что они симбатны зависимостям k* = f(ν) (рис. 1), а для ПАМС и ОЭЦ зависимости размерных характеристик имеют, в целом, убывающий характер, что антибатно соответствующим зависимостям k* от ν для этих ПС (рис. 1 и 2). Для ПМАК зависимость R^*_h = f(ν) имеет экстремальный характер с максимумом при ν = 0.1 и не коррелирует с зависимостью k* = f(ν) (рис. 2). Таким образом, в многокомпонентных системах с конкурентными вкладами различных параметров строгой зависимости величины k* от одного из параметров ПС не наблюдается, а величина R^*_h в значительной мере определяется термодинамической жесткостью макромолекул ПС. Важно отметить, что во всем диапазоне ν размеры наноструктур (за исключением наноструктур на основе жесткоцепного полимера ОЭЦ) не превышают 100 нм (таблица 2).

При получении селенсодержащих наносистем могут реализоваться два типа стабилизации: стерическая или электростерическая стабилизация наночастиц Se полимерной матрицей. Согласно литературным данным [13], стерическая стабилизация в водных средах базируется на двух эффектах: (1) энтропийном эффекте, вызываемом уменьшением конфигурационной свободы полимерных цепей в области между частицами за счет гидрофобных взаимодействий и (2) осмотическом эффекте, возникающем из-за повышенной концентрации полимера в области между частицами.

Рис. 1. Зависимость константы скорости образования нанокомпозита k* от ν для полимерных матриц: 1 - ПВП, 2 - ПТМАЭМ, 3 - ПАМС, 4 - ОЭЦ, 5 - ПМАК.

Рис. 2. Зависимость R^*h наноструктуры от ν для полимерных матриц: 1- ПВП, 2 - ПТМАЭМ, 3 - ПАМС, 4 - ОЭЦ, 5 -ПМАК.

Напротив, в случае полиэлектролитов осуществляется электростерическая стабилизация наночастиц в водной среде, которая представляет собой комбинацию двух типов взаимодействий: электростатического отталкивания и энтропийно-осмотического эффекта. По типу стабилизации, выбранные нами ПС можно разделить на две группы: в первую группу входят ПВП, ОЭЦ и ПМАК (в исследуемой области рН = 3.1-3.3 ПМАК находится в неионизованном состоянии), при использовании которых реализуется стерическая стабилизация; вторую группу образуют ПС, находящиеся в ионизованном состоянии – ПТМАЭМ и ПАМС. Формирование селенсодержащих наносистем на основе ПТМАЭМ и ПАМС происходит по механизму электростерической стабилизации. Стерическая стабилизация для ярко выраженных гидрофобных ПС, таких как ПМАК, за счет усиления энтропийного эффекта, должна приводить к более плотной упаковке полимерных макромолекул на нанокластерах Se, чем в случае электростерической стабилизации (при использовании ПТМАЭМ и ПАМС) или стерической стабилизации с менее выраженным энтропийным эффектом (ПВП и ОЭЦ).

Рис. 3. Зависимость оптической плотности D от длины волны λ для селенсодержащих нанокомпозитов на основе разных ПС при ν =0,1: 1- без ПС; 2- с ПВП; 3- с ПАМС; 4- с ПМАК; 5- с ПДМАЭМ; 6- с ОЭЦ.

Следует отметить также, что величина оптической плотности сильно различается для всех нанокомплексов при фиксированном массовом соотношении селен : полимер ν (например, при ν=0.1). Наибольшее значение оптической плотности наблюдается для селенсодержащего нанокомпозита на основе ПМАК, что можно объяснить максимальной гидрофобностью этого ПС и одновременно отсутствием электростатических взаимодействий.

По-видимому, стерическая стабилизация, для сильно гидрофобных ПС (ПМАК) должна приводить к более плотной упаковке органического вещества на нанокластере селена, чем в случае электростерической стабилизации (ПДМАЭМ и ПАМС) или стерической стабилизации с менее выраженным гидрофобным эффектом.

Результаты определения размеров образующихся селенсодержащих наноструктур в области насыщения адсорбционной емкости ν = 0.1, полученные методом ДСР, хорошо согласуются с данными, полученными методом АСМ. На рис. 4 приведены АСМ изображения поверхности тонких пленок, полученных из растворов ПМАК-нано-а-Se⁰, ПТМАЭМ-нано-а-Se⁰ и ПАМС-нано-а-Se⁰ при ν = 0.1. На поверхности всех образцов хорошо видны изолированные наноструктуры, имеющие четкую сферическую форму. Оценка размеров наноструктур дает диапазон значений радиусов R_АСМ = 50 - 120 нм для ПМАК-нано-а-Se⁰ (по данным ДСР R_h^*= 90 нм (таблица 2); наносистема ПТМАЭМ-нано-а-Se⁰ представляет собой в основном изолированные частицы с размерами R_АСМ = 70 - 300 нм (R_h^* = 70 нм), достаточно равномерно распределенные по поверхности пленки; для ПАМС-нано-а-Se⁰ наблюдаются как отдельные частицы с размерами R_АСМ = 90 - 280 нм (R_h^*= 90), так и агрегаты, состоящие из 3-5 частиц.

а

б

в

Рис. 4. АСМ изображения поверхности тонких пленок, полученных из водных растворов композитов при ν = 0.1: а- ПМАК-нано-а-Se⁰; б- ПТМАЭМ-нано-а-Se⁰ ; в - ПАМС-нано-а-Se⁰. Площадь сканирования 3×3μm².

Таким образом, установлено, что природа полимерной матрицы оказывает существенное влияние на процесс самоорганизации наноструктур и их размеры. Экспериментально показано, что в области насыщения адсорбционной емкости наночастиц селена, образуются селен – полимерные наноструктуры сферической формы.

Для анализа цитотоксичности из ряда полученных систем была выбрана наносистема на основе физиологически активного полимера ПВП. Оценку цитотоксичности проводили на клетках «ФЛЕЧ». Установлен диапазон концентраций Se, в котором наносистема ПВП-нано-а-Se⁰ не показала токсичности, но сохранила биологическую активность. Это открывает перспективы использования селенсодержащих нанокомплексов в качестве лекарственных препаратов широкого спектра действия, в частности – противоопухолевых препаратов и препаратов, компенсирующих дефицит селена в организме.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, проект № 10-03-01075.

Литература

1. Yoshizawa, K., Willett, W.C., Morris, S.J. Study of prediagnostic selenium levels in toenails and the risk of advanced prostate cancer// J.Natl.Cancer Inst. 1998.V. 20. P. 1219-1224.

2. Абдуллаев, Г.М., Зейналлы, Э.М., Сафаров, Ю.И. Об изменениях концентрации селена при заболеваниях гепатобилиарной системы // Врачебное дело. 1978. №11. С.35-37.

3. Yu, S.Y., Zhu, Y.J., Li, W.G. Chemoprevention trial of human hepatitis with selenium supplementation in China // Biol. Trace Element Res. 1997.V. 51. № 1. P.117-124.

4. Копейкин, В. В., Валуева, С. В., Киппер, А. И., Боровикова, Л. Н., Филиппов, А. П. Синтез наночастиц селена в водных растворах поливинилпирролидона и морфологические характеристики образующихся нанокомпозитов// Высокомолек. соед. 2003.Т. 45 А. №4. С. 615-622.

5. Валуева, С.В., Боровикова, Л.Н., Коренева, В.В., Назаркина, Я.И., Киппер, А.И, Копейкин, В.В. Структурно-морфологические и биологические свойства наночастиц селена стабилизированных бычьим сывороточным альбумином// Журн. физ. химии. 2007. Т.81.№ 1. С.1329-1333.

6. Валуева, С.В., Боровикова, Л.Н., Вылегжанина, М.Э., Суханова, Т.Е. Морфология и термодинамические характеристики селенсодержащих наноструктур на основе полиметакриловой кислоты// Журн.физ. химии.- 2010. Т. 84. № 9. С.1619-1623.

7. Валуева, С. В., Киппер, А. И., Боровикова, Л. Н., Матвеева, Н. А. Влияние природы наночастицы и полимерной матрицы на морфологические характеристики полимерных наноструктур// Журн.физ. химии. 2010. Т. 84. № 12. С. 2110-2115.

8. Валуева С.В, Киппер А. И., Копейкин В.В, Боровикова Л.Н., Иванов Д. А., Филиппов А. П. Влияние молекулярной массы полимерной матрицы на морфологические характеристики селенсодержащих наноструктур и на их устойчивость к воздействию гидродинамического поля // Выcокомолек. соед. 2005.Т.47А. №3. С.438-443.

9. Копейкин, В. В., Валуева, С. В., Киппер, А. И., Калинина, Н. А., Силинская, И. Г., Хлебосолова, Е. Н., Шишкина, Г. В., Боровикова, Л.Н. Самоорганизация молекул поли-2-акриламидо-2- метилпропансульфокислоты и додецилсульфата натрия на наночастицах нульвалентного селена//Высокомолек. соед. 2003. Т. 45 А. № 6. С. 963-969.

10. Копейкин, В.В., Валуева, С.В., Киппер, А.И., Боровикова, Л.Н., Назаркина, Я.И., Хлебосолова, Е.Н., Филиппов, А.П. Эффект адсорбции оксиэтилцеллюлозы на наночастицах селена в процессе их формирования в воде// ЖПХ. 2003. Т. 76. № 4. С. 621-623.

11. Копейкин, В.В., Валуева, С.В., Киппер, А.И., Филиппов, А.П., Хлебосолова, Е.Н., Боровикова, Л.Н., Лаврентьев, В.К. Исследование формирования частиц нано-Se⁰в водном растворе катионного полиэлектролита// ЖПХ. 2003. Т. 76. № 5. С. 847-851.

12. Walrafen, G.E. Raman Spectral Studies of Aqueous Solutions of Selenious Acid// J. Chem. Phys. 1962. V. 36.№ 90. P. 9-1.

13. Mayer, A.B.R. Colloidal Metal Nanoparticles Dispersed in Amphiphilic Polymers// Polym. Adv. Technol. 2001.V.12. P. 96 -106.