Экология /6. Экологический мониторинг

Вятчина О.Ф., Жданова Г.О.

Иркутский государственный университет, Россия

Оценка снижения токсичности тяжелых металлов гуматами с использованием Saccharomyces cerevisiae

Гуминовые вещества оказывают различные эффекты на биологические объекты. Широко известна способность гуминовых веществ инкорпорировать некоторые токсиканты (металлы, пестициды, радионуклиды и пр.) и надолго выводить их из сферы прямых контактов с живыми клетками. Причем с течением времени трансформация самих ГВ может сопровождаться разрушением некоторых токсичных органических соединений или превращением их в неактивные (нетоксичные) соединения [2, 3].

Целью исследований явилось изучение воздействия гуматов на некоторые метаболические процессы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также регистрация эффектов их влияния на систему «дрожжи – токсикант».

В качестве объекта исследования использовали культуру Saccharomyces cerevisiae, коммерческий препарат сухих инстантных пекарских дрожжей «Саф-Момент» (Lesaffre, Франция). Для культивирования использовали среду IEPD следующего состава (г/л): глюкоза – 20, пептон основной – 10, автолизат дрожжевой – 5, агар – 23. При проведении исследований использовали препарат «Powhumus» (производство Humintech Ltd., Дюссельдорф, Германия), содержащий калиевую соль гуминовых кислот.

Способность гуматов снижать токсичность солей тяжелых металлов оценивали при инкубировании дрожжей в течение 3 часов в стерильной воде и при их культивировании в жидкой среде IEPD в течение 24 часов, варьируя последовательность добавления сульфата меди (0,1 %) и препарата «Powhumus» (0,1 %). Количество жизнеспособных клеток определяли методом Коха и путем прямого микроскопирования суспензии. Чтобы определить роль связывания гуматами солей тяжелых металлов в их детоксикации в стерильный 0,1%-ный раствор испытуемого металла вносили гумат (конечная концентрация 0,1 и 0,2 %). Образовавшийся осадок отфильтровывали, в полученный раствор вносили 0,3 мл двухсуточной культуры дрожжей (титр ~10⁶ КОЕ/мл), инкубировали в течение трех часов на качалке при комнатной температуре и определяли остаточную токсичность раствора по количеству жизнеспособных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae методом Коха. В контрольных вариантах дрожжи инкубировали в 0,1%-ных растворах солей тяжелых металлов и в воде.

Также оценивали детоксицирующий эффект препарата «Powhumus», используя оригинальную методику, основанную на том, что в качестве тест-отклика используется способность пекарских дрожжей S. cerevisiae, как дрожжей верхового брожения, образовывать пену на поверхности сбраживаемой жидкости. Степень токсичности тестируемых соединений в данном методе оценивают по их влиянию на скорость пенообразования в суспензии дрожжей с глюкозой [1].

Сульфат меди оказывал сильное токсичное действие на культуру S. cerevisiae. При выдерживании клеток дрожжей в 0,1%-ном растворе резко снижалась их жизнеспособность (с 1,28±0,27×10⁷ до ~10¹ КОЕ/мл). При добавлении гумата в концентрации 0,1 и 0,2 % в исследуемый раствор происходило выпадение осадка, обусловленное связыванием гумата с сульфатом меди. Оценка остаточной токсичности исследуемых растворов по жизнеспособности дрожжей показала более высокий эффект гумата в концентрации 0,2 %. Количество клеток дрожжей достоверно (при Р=0,95) не отличалось от такового в контроле (3,68±0,45×10⁷ и 1,28±0,27×10⁷ КОЕ/мл, соответственно). Аналогичный эффект был получен в опыте по детоксикации гуматом нитрата кобальта (рис. 1).

Рис 1. Оценка остаточной токсичности 0,1%-ных растворов сульфата меди и нитрата кобальта после осаждения гуматом

Также эффект детоксикации гуматом тяжелых металлов оценивали по тест-реакции, основанной на фиксации скорости подъема пены в суспензии дрожжей с глюкозой. Оценка протекторного действия гуматов в системе дрожжи – медь сернокислая показала, что предварительное выдерживание клеток дрожжей в растворе гумата приводило к нивелированию токсического эффекта. Скорость пенообразования в исследуемой дрожжевой суспензии составляла 0,220±0,005, в то время как без обработки клеток гуматом сульфат меди оказывал сильный токсический эффект по отношению к дрожжам, что выражалось в снижении интенсивности пенообразования (0,01±0,002). Аналогичные данные были получены в опыте с нитратом кобальта (табл. 1).

Таблица 1

Исследование влияния гумата (0,1%) на токсичность Cо(NO₃)₂ (0,1%) и СuSO₄ (0,1 %) методом определения пенообразующей способности дрожжей

№	Вариант опыта	Скрость подъема пены, мл/мин
		СuSO4	Cо(NO3)2
1	0,1%-ный гумат +дрожжи (30 мин) + 0,1 % Me + глюкоза	0,220±0,005	0,082±0,007
2	0,1% Me + дрожжи (30 мин) + глюкоза	0,01±0,002	0,004±0,003
3	0,1% Me + дрожжи (0 мин) + глюкоза	0,07±0,002	0,009±0,003
4	0,1 % гумат (0 мин)	0,23±0,005	0,264±0,01
5	0,1 % гумат (30 мин)	0,27±0,005	0,336±0,009
6	Контроль (0 мин)	0,225±0,005	0,34±0,007
7	Контроль (30 мин)	0,26±0,0025	0,318±0,009

Примечание: t_табл = 2,1; значения t_d в опыте с СuSO₄ t_{d 1-2} = 39, t_{d 2-3} = 21,2; t_{d 4-5} = 5,7; t_{d 7-6} = 6,3; t_{d 4-6} = 0,7;

в опыте с Cо(NO₃)₂; t_{d 1-2} = 10,24; t_{d 2-3} = 1,17; t_{d 4-5} = 5,35; t_{d 7-6} = 1,9.

Литература

1. Вятчина О. Ф. Экспрессный приём биологического анализа качества вод с помощью сахаромицетов / О. Ф. Вятчина, Г. О. Жданова, Д. И. Стом // Естественные науки. – 2009. – № 4 – С. 133-136.

2. Chin Y. P. Binding of pyrene to aquatic and commercial humic substances: the role of molecular weight and aromaticity / Y. P. Chin, G. R. Aiken, K. M. Danielsen // Environ. Sci. Technol. - 1997. - 31. - P. 1630-1635.

3. Haitzer Effects of dissolved organic matter (DOM) on the bioconcentralion of organic chemicals in aquatic organisms - a review / M. Haitzer, S. Hoss, W. Traunspurger et al. // Chemosphere. - 1998. – 37. - P. 1335-1362.