Сокуева Н.А. ¹, Сокуев Р.И. ¹, Сяткин С.П.²

¹ - Лаборатория биотехнологии ИБХ РАН, Москва.

² - Кафедра биохимии медицинского факультета Российский Университет Дружбы Народов (РУДН), Москва.

Функциональный анализ 5’-регуляторной области гена Trithorax-like Drosophila melanogaster

Одним из ключевых этапов регуляции экспрессии генов является сложный и контролируемый многими факторами процесс транскрипции, а изучение регуляции транскрипции является одной из важнейших задач современной биологии. К настоящему времени определена экзон-интронная структура гена Trl, выявлена ткане- и стадиеспецифичность экспрессии, зависимость его активности от внешних условий. Показано наличие нескольких стартов транскрипции и альтернативных вариантов некоторых экзонов. Можно предполагать, что такая сложная, зависящая от многих факторов, экспрессия данного гена определяется работой сложной системы регуляторных элементов. Однако к настоящему времени система регуляции экспрессии гена Trl практически не изучена.

Целью настоящей работы было проведение функционального анализа 5’-регуляторной области гена Trl для выявления расположенных в ней функционально-значимых участков, оказывающих наибольшее влияние на транскрипцию гена. Для этого необходимо было получить мутации, затрагивающие 5’- область гена Trl, путем эксцизии P-элемента; прокартировать полученные мутации; изучить экспрессию гена Trl у мутантов и изучить влияние мутаций на онтогенез мух.

В результате эксперимента по индуцированию делеций, затрагивающих район 5’-области гена Trl, с помощью неточной эксцизии P-элементa {EP} типа, расположенного в позиции 3269 (координаты здесь и далее даны в соответствии с последовательностью AJ225042, EMB), было получено 238 линий. Наличие или отсутствие делеций прилегающего к месту встройки P-элемента района определялось с помощью ПЦР.

В результате проведенного ПЦР анализа было выявлено:

· 182 линий, для которых характерна полная эксцизия P-элемента, которая не сопровождалась перестройками в гене Trl;

· 32 линии, в которых не были выявлены эксцизия P-элемента и соответственно делеции прилегающих районов. Наличие белых глаз у мух может быть обусловлено повреждением гена mini-white в {EP} транспозоне;

· 18 линий, в которых P-элемент вырезался частично;

· 6 линий, в которых эксцизия P-элемента вызвала делеции прилегающих к месту встройки P-элемента областей.

В результате анализа из 6 линий, несущих мутации, затрагивающие 5’-регуляторную область было отобрано две: Trl^4-83 и Trl^4-285. Две отобранные мутации являются делециями (рис.1), удаляющими участки 5’-области. У мутантов Trl^4-83 (рис.1,Г) удален фрагмент длиной 989 п.о. в положении 2286-3275, в котором локализованы 3 первых сайтов инициации транскрипции, картированные в яичниках с помощью метода продления праймера. Делеция Trl^4-285 (рис.1,Д) удаляет фрагмент длиной в 306 п.о. в 3’-сторону от места встройки исходного P-элемента (3277-3583), который включает 1d экзон и участок первого интрона. Помимо этих двух линий в работе были использованы еще две, полученные ранее, - Trl^3-62(22) (рис.1,Б) и Trl^3-62(15) (рис.1,В), также содержащие делеции 5’-регуляторной области.

Проведен сравнительный цитогенетический и молекулярно-биологический анализ мутантов, несущих делеции, удаляющие разные участки 5’-области гена Trl с помощью окрашивания яйцевых камер с помощью фаллоидина и DAPI и нозерн-блот анализа. У мутантов уровень экспрессии гена Trl снижен по сравнению с контролем, что, по-видимому, приводит в выявленным нарушениям в яйцевых камерх мутантов: в числе питающих клеток, в распределении фолликулярных клеток и в полимеризации актиновых филаментов.

Рис. 1. Мутации, затрагивающие 5’-регуляторную область гена Trl. Треугольником обозначено место встройки P-транспозона. Стрелками – сайты инициации транскрипции, картированные в яичниках. (А) исходная линия. (Б,В)- ранее полученные мутации, (Г,Д) – мутации, полученные в данной работе.

Выводы исследования:

Показано, что два фрагмента размером 479 п.о. и 197п.о. имеют наибольшее значение для обеспечения нормального уровня экспрессии гена Trl и жизнеспособности мутантов.

Установлено, что удаление фрагмента размером 479 п.о. приводит к стерильности самцов, а участка размером 99 п.о., в котором локализованы два первых сайта инициации транскрипции, – к стерильности самок.

Удаление фрагмента размером 306 п.о. приводит к снижению жизнеспособности и фертильности мух и уровня экспрессии гена Trl, что предполагает наличие в нем функционально-значимых сайтов.