Головань А.В., Загородня С.Д., Опанасенко О.І.

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

ДОСЛІДЖЕННЯ АПОПТОЗСТИМУЛЮЮЧОЇ ДІЇ ПРЕПАРАТІВ АКТИВНИХ ПРОТИ ВІРУСУ ЕПШТЕЙНА - БАРР

Останніми роками було досягнуто значного прогресу в з’ясуванні молекулярних механізмів вірусного онтогенезу. Зокрема, стало відомо, як функціонують і взаємодіють між собою продукти вірусних і клітинних онкогенів, а також продукти генів – супресорів пухлинного росту . Ці дані дозволили розпочати розробку противірусних препаратів, придатних для використання в онкологічній практиці.

Вважається , що приблизно 15% пухлин людини мають вірусну етіологію [3]. Інфікування клітин онкогенними вірусами in vitro веде до утворення скупчень ( фокусів) клітин зі зміненою морфологією, які здатні до багатошарового росту на субстраті. Ці та деякі інші набуті клітинами властивості стають незворотніми і в ряді випадків уже не вимагають подальшої присутності онкогенних вірусів у клітинах. У процесі такої трансформації змінюється не лише морфологія клітини, але й їх функції[1].

Важливо відмітити, що деякі онкогенні вірусу асоційовані з розвитком пухлин певного типу, тоді як інші віруси беруть участь у патогенезі різних злоякісних новоутворень. Очевидно, ці властивості зумовлені тропізмом вірусів до клітин певного типу[2]. Незаперечним « лідером » тут вважається вірус Епштейна-Барр (ЕBV), здатний інфікувати Т – і В – лімфоцити, епітеліальні клітини і навіть клітини гладких м’язів. ЕVB властивий для лімфоми Беркітта, деяких Т – клітинних лейкозів, пухлин В – клітинної природи, пов’язаних із вродженим чи набутим імунодефіцитом, з недиференційованим раком носоглотки, шлунка, легені, слинної, навколо вушної, молочної залоз[4].

Значення вірусу EBV у формуванні злоякісного фенотипу клітин лімфоми було продемонстроване Дж. Комано та співав. З EBV – позитивної лінії Akata клітин лімфоми Беркітта методом кінцевих розведень були відібрані клони, що не містили EBV, які потім піддавалися повторному зараженню цим вірусом. Як виявилось, такі клони ( на відміну від неінфікованих вірусом EBV ) здатні рости на середовищі з напіврідким агаром і утворювати пухлини in vivo. При цьому EBV – позитивні клони клітин лімфоми Беркітта проявляли значно більшу резистентність до апоптозу, ніж EBV – негативні колонії клони . Тому автори прийшли до висновку, що для розвитку злоякісного фенотипу і стійкості до апоптозу в клітинах лімфоми Беркітта необхідна постійна присутність EBV [6].

ЕBV – герпесвірус, здатний імморталізувати В – лімфоцити людини in vitro . Цей вірус може також трансформувати in vivo нормальні В – клітини , які знаходяться в стані спокою ( у тому числі циркулюючі В – лімфоцити ), в імунобласти[5]. Для клітин людини трансформуююча ( імморталізуюча ) здатність цього віруса суттєво превищує можливості відомих трансформуючих вірусів [6]. Вивчення впливу антивірусних препаратів на розвиток пухлин є актуальним питанням на сьогодні.

Мета роботи: дослідження апоптозстимулюючої дії препаратів активних проти ЕBV.

Матеріали і методи:

Об’єктом нашого дослідження був рівень впливу похідних цитидину (6 – азацитидин (( 6-АЦ) і 2'-3'- секо- 5-метил-6-АЦ) на репродукцію ЕVB та процес апоптозу в культурі лімфобластоїдних клітин. Досліджувані препарати синтезовано в Інституті молекулярної біології і генетики НАНУ та люб’язно надана для досліджень. В роботі була використана культура клітин Raji – В - лімфоцити людини, трансформовані ЕBV, які мають в своєму геномі 63 копії вірусного генома, але не продукують вірусні частки, а лише окремі ранні антигени.

Структурні формули досліджуваних речовин представлені на рисунку 1.

6-азацитидин, 2-b-D-рибофуранозил-5-аміно-1,2,4-триазин-3(2Н)-он (6-АЦ) (препарат №1); мол. масса -244,2;	2'-3'- секо-5-метил-6-АЦ (препарат №2); мол. масса -260,25;

Рис.1 Структурні формули досліджуваних речовин - 6 – АЦ та 2'-3'- секо-5-метил-6-АЦ

В роботі використовували наступния метод отримання фрагментованої ДНК:

- клітини, попередньо інфіковані вірусом були розділені центрифугуванням при 1500 об/хв на 2 фракції(О – осад ;S – супернатант);

- в послідовності до культури інфікованих клітин були додані необхідні реагенти(10 % і РНК-аза, протеїнкіназа, 3 мМ Na-ацетат, етанол) з наступним їх центрифугуванням;

- осад розчиняли в буфері та наносили на 1,5 % агарозу з етидій бромідом, після чого проводили електрофорез при 120 В ( 10 мА)

- переносили гель на скло трансілюмінатора і розглядали отримані результати в ультрафіолетовому світлі.

Згідно з методичними рекомендаціями з доклінічних дослідженнь потенційних антивірусних препаратів in vitro, речовина, показник SI ( індекс селективності), якої вище за 16, є перспективною для подальших розробок.

Показники SI для похідних цитидину 6 – АЦ і «секо»-6-АЦ SI : 240 і 180 відповідно [Nesterova N.,.Dyachenko N, Alexeeva I., Zagorodnaya S., Baranova G. Studying of AntiEpstein-Barr Virus Activity of 6-Azacytidine and its Acyclic Derivative// Antiviral research.-2003 .-P. 71]. Це дозволило встановити рівень перспективності препаратів для дослідження їх апоптозмодулюючих властивостей.

Результати та їх обговорення:

ВЕБ-інфекція характеризується трьома фазами: гостра, латентна та активація. Периферійна кров та органи лімфоїдної тканини є як правило місцями спокою для латентно інфікованих ВЕБ лімфоцитів. Однак, якщо організм зазнає імуносупресії, латентно інфіковані клітини реактивуються, відновлюють клітинну проліферацію та вірусну реплікацію. Симптоми реактивованої ВЕБ-інфекції відрізняються від симптомів первинного інфікування, так як асоціюються в основному зі злоякісними пухлинами.

Зростання кількості захворювань, які пов’язують з ВЕБ інфекцією підкреслює важливість розробки ефективної вакцини, яка зможе захистити проти захворювання або для вірус-асоційованих злоякісних пухлин це розробка антивірусних агентів, які б могли знищувати уражені вірусом клітини, зокрем стимулюючи апоптоз. Похідні цитидину 6 – азацитидин і 2'-3'-секо-метил-6-азацитидин є перспективними для вивчення апоптозмодулюючих властивостей.

При дослідженні впливу препаратів на розвиток апоптозу в клітині інфікованій вірусом Епштейна-Барр застосовували електрофоретичне розділення ДНК з метою виявлення апоптозспецифічної фрагментації. Препарати використовували в таких концентраціях: 50, 125, 250 мкг/мл. У результаті проведення електрофорезу в агарозному гелі на трансілюмінаторі в ультрафіолетовому світлі були отримані даніпредставлені на рисунку 2.

Рис.2 Фрагментація ДНК

М - маркер 50-1000 п.н.; м - маркер 200-10000 п.н.; 1 – контроль клітин ,(О); 2 – клітини, інфіковані вірусом ,(О); 3 - контроль клітин з внесеною досліджуваною речовиною 6АС(50 мкг/мл), (S); 4 - клітини, інфіковані вірусом з 6АС(50 мкг/мл), (S); 5 - контроль клітин з 6АС(50 мкг/мл), (О); 6 - клітини, інфіковані вірусом з 6АС(50 мкг/мл), (О); 7 - контроль клітин з секо 6АС(240 мкг/мл), (S); 8 - клітини, інфіковані вірусом з секо 6АС(240 мкг/мл), (S); 9 - контроль клітин з секо 6АС(240 мкг/мл), (О); 10 - клітини, інфіковані вірусом секо 6АС(240 мкг/мл), (О); 11 - контроль клітин з секо 6АС (50 мкг/мл ), (S); 12 - клітини, інфіковані вірусом з секо 6АС( 50 мкг/мл), (S); 13 - контроль клітин з секо 6АС( 50 мкг/мл), (О); 14 - клітини, інфіковані вірусом з секо 6АС (50 мкг/мл), (О).

Отже, як видно з представленого рисунку фрагментація спостерігається при додаванні обох препаратів в різних концентраціях. Препарат 2'-3'- секо-5-метил-6-АЦ проявляє активність в концентраціях 240 мкг/мл та 50 мкг/мл, препарат 6 – АЦ в концентрації 50 мкг/мл. На рівні позначки маркерів можна побачити поділки рівня фрагментації. Це свідчить про те, що досліджувані речовини є перспективними для подальшого вивчення та модернізацій.

ВИСНОВКИ

1. Було розглянуто механізм процесу апоптоза в клітині, інфікованій EBV.

2. Досліджено апотозмодулюючі властивості досліджуваних препаратів (6 – АЦ та 2'-3'- секо-5-метил-6-АЦ)

2. Було встановлено залежність рівня апоптозу в інфікованих препаратах від концентрації внесеного препарату.

Література

1. Молчанець О.В. Основи вірусного канцерогенезу: Курс лекцій для студентів біологічного факультету. К.: Фітосоціоцентр,2007.- С. 130 – 140.

2. Посевая Т.А., Цукерман В.Г. и др. //Вопр. вирусол. 1991; 1: - С. 78.

3. Савцова З.Д., Гриневич Ю.А., Вирусные инфекции, ассоциированные с онкологическими заболеваниями человека.// Сучасні інфекції, 2000, №3, - C. 70-83.

4. Фільченко О.О., Стойка Р.С. Апоптоз і рак: від теорії до практики.- Т.,ТДМУ, 2006, 374 с.

5. Boucher Ch., Galasso G.A. Practical Guidelines in Antiviral Therapy// Elsevier, Amsterdam. - 2002. – Р. 344.

6. Gershburg E., Pagano J.S. et al. Epstein – Barr virus infection: prospects for treatment// Jornal of antimicrobial chemotherapy antiviral.- 2005;56: - Р. 277 – 281.