Биологические науки/6.Микробиология

 

Теремова М.И.,  Воробьева С.В., д.бн. Хижняк С.В.,

к.х.н. Романченко А.С., Баранов М.Е.

Красноярский научный центр СО РАН, Россия

Красноярский государственный аграрный университет, Россия

Институт химии и химической технологии СО РАН, Россия

Сибирский государственный аэрокосмический университет имени академика М.Ф. Решетнева, Россия

 

Использование метода атомно-силовой микроскопии в изучении биодеструкции полиэтилена высокого давления

В настоящее время  производство полиэтилена  в мире достигает 80  миллионов тонн в год  [7]. Отработанная полиэтиленовая пленка  наносит вред окружающей среде, замусоривая землю и препятствуя росту растений  из-за нарушения воздухо- и влагообмена в почве [5]. Для разработки способов ускорения деградации полиэтилена осуществляется активный поиск штаммов, способных использовать полиэтилен в качестве источника углерода [1, 3, 4, 6]. В связи с гидрофобностью полиэтилена, особое внимание уделяется способности микробных клеток к взаимодействию с гидрофобными поверхностями [2, 6].

Настоящая работа посвящена оценке способности углеводородокисляющих  бактерий, а также бактерий, способных к росту в глубинной культуре на среде с жидким полиэтиленом, к сорбции на поверхности полиэтилена высокого давления и к его биологической деструкции с использованием метода атомно-силовой микроскопии. Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 10-08-91157-ГФЕН_а).

Объектами исследования служили бактериальные культуры, способные к росту на минеральной среде с летучими и нелетучими углеводородами в качестве единственного источника углерода: 1) культуры бактерий, выделенных из загрязнённых нефтепродуктами грунтовых вод из наблюдательных скважин на территории филиала "Центральный" ОАО "Красноярскнефтепродукт"; 2) культура бактерий, выделенная из загрязнённых отработанным компрессорным маслом сточных вод ОАО "Красмаш"; 3) культура бактерий, выделенных из  накопительной культуры  микроорганизмов,  культивируемой  на жидкой минерально-солевой среде с ионообменной смолой и способная утилизировать жидкий полиэтилен. Бактерии суспензировали в жидкой минеральной среде следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 – 1; MgSO4 - 0,2; K2HPO4 – 0,5; pH =7.

Для оценки способности бактерий к сорбции и росту на поверхности полиэтилена суспензии (~105 клеток/мл) наносили в виде капель объёмом 100 мкл на поверхность полиэтиленовой  пленки высокого давления (толщина 0,025+0,005 мм), используемой в тепличном хозяйстве и инкубировали во влажной камере при температуре +18..+22ºC в течение 18 суток. После этого образцы плёнки промывали проточной водой и анализировали с помощью оптического микроскопа Микмед-6 (ООО "ОМО", Санкт-Петербург) с использованием фазово-контрасного устройства. Для изучения воздействия бактерий на полиэтилен инкубацию проводили в течение  30 суток в тех же условиях, после чего образцы промывали и проводили атомно-силовую микроскопию с помощью сканирующего мультимодового зондового микроскопа Solver P47 (НТ-МДТ, Москва), используя программу управления микроскопом «NOVA».

Все изученные культуры способны к адсорбции на полиэтилен и  образованию на его поверхности биоплёнок и микроколоний (рис. 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рисунок 1 – Пример роста углеводородокисляющих бактерий, выделенных из загрязнённых нефтепродуктами грунтовых вод, на полиэтиленовой плёнке: 1 – рост в виде слоя клеток, 2 – рост в виде микроколонии

 

Это свидетельствует о том, что изучаемые бактерии не только способны сорбироваться на гидрофобной поверхности, но и могут использовать полиэтилен в качестве единственного источника углерода.

Использование бактериями полиэтилена подтверждается результатами атомно-силовой микроскопии. После воздействия на полиэтилен всеми изучаемыми культурами наблюдается изменение его поверхности в виде появления характерных пиков (рис. 2, 3, 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рисунок 2 – Трёхмерные изображения поверхности образцов полиэтилена, построенные по результатам атомно-силовой микроскопии: 1 – исходная плёнка; 2 – плёнка, подвергшаяся воздействию бактерий, выделенных  из грунтовых вод

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рисунок 3 – Трёхмерные изображения поверхности образцов полиэтилена, построенные по результатам атомно-силовой микроскопии: 1 – исходная плёнка; 2 – плёнка, подвергшаяся воздействию бактерий, выделенных из  накопительной культуры  микроорганизмов,  культивируемой  на жидкой минерально-солевой среде с ионообменной смолой

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Рисунок 4 – Трёхмерное изображение поверхности образца полиэтилена, построенное по результатам атомно-силовой микроскопии: плёнка, подвергшаяся воздействию бактерий, выделенных из загрязнённых компрессорным маслом сточных вод ОАО "КрасМаш"; исходная плёнка при том же разрешении показана на рис. 3

 

Углеводородокисляющие бактерии, выделенные из загрязнённых нефтепродуктами грунтовых вод и промышленных стоков, способны абсорбироваться и расти на поверхности полиэтиленовой плёнки высокого давления, вызывая эрозию её поверхности. Аналогичными свойствами обладают бактерии, выделенные из ассоциации, длительное время поддерживавшейся на среде с ионообменной смолой и способные к росту в среде с жидким полиэтиленом в качестве единственного источника углерода. Это позволяет рекомендовать данные бактериальные культуры в качестве биодеструкторов полиэтилена.

 

 

 

Литература:

1.     Агзамов, Р.З. Деградация полиэтиленовых пленок в жидких средах и оценка  их грибостойкости по степени  развития плесневого гриба // Р.З. Агзамов, Э.А. Рафаилова, А.В. Панкова / Мат-лы науч.-практ. конф. Становление и достижение биохимической школы  Казанского университета. – Казань, 2009. С.10-12

2.     Arkatkar,  A. Approaches to Enhance the Biodegradation of Polyolefins // The Open Environmental Engineering Journal / A. Arkatkar, J. Arutchelvi, M. Sudhakar, S. Bhaduri, P.V. Uppara,  M. Doble. 2. 2009. P. 68-80 

3.     Balasubramanian, V.  Isolation of Efficient Polyethylene Degrading Bacterial Species from Marine Ecosystem of Gulf of Mannar in India // J. Soil Sci. Plant Nutr. / V.Balasubramanian,  N. Ramesh, C.S. Sumathi, V.R. Kannan. 8 (3), 2008. P. 268

4.     Balasubramanian, V. High-density polyethylene (HDPE)-degrading potential bacteria from marine ecosystem of Gulf of Mannar, India // Letters in Applied Microbiology / V. Balasubramanian, K. Natarajan, B. Hemambika, N. Ramesh, C.S. Sumathi, R. Kottaimuthu, V. Rajesh Kannan. - Volume 51, Issue 2, 2010. P. 205–211

5.     Hakkarainen, M. Long Term Properties of Polyolefins //  Advances in Polymer Science / M. Hakkarainen, A. Albertsson. - Volume 169, 2004. P. 177-200

6.     Gilan (Orr)  Colonization, biofilm formation and biodegradation of polyethylene by a strain of Rhodococcus rubber // Applied Microbiology and Biotechnology /  Gilan (Orr), Y. Hadar, A. Sivan. – Volume 65, Number 1, 2004. P. 97-104

7.     Piringer, O.G. Plastic packaging: interactions with food and pharmaceuticals (2nd ed.) / O.G Piringer, A.L. Baner. - Wiley-VCH, 2008. – 632 pp.