*112775*

УДК 612.111

БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ КРОВИ БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ И АГРЕГАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ, КАК ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО КОМПОНЕНТА В ОБЩЕЙ КАРТИНЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК

Белкин А.В., Белкина Н.А., Богданова А.Б., Верхоланцева А.Р., Добрынина Н.Г., Кравченко С.В., Лыткина Е.Ю., Мельникова А.А., Морозова Д.В., Сапожникова А.Д., Шульга В.О.

Тюменский государственный университет, департамент биологии, г. Тюмень, Россия

В настоящее время, очевидно, что свободнорадикальное окисление является одним из физико-химических регуляторных механизмов. Длительное и значительное изменение интенсивности свободнорадикального окисления, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения характерно для патологических состояний живого организма [1]. Активация свободнорадикальных процессов обусловливает нарушения гемореологических свойств, реализуемых через повреждения циркулирующих эритроцитов, оказывая опосредованное влияние на другие показатели кислородтранспортной функции крови и транспорт кислорода в ткани [2].

Сердечнососудистые заболевания в XX веке приняли характер эпидемии, охватившей все высокоразвитые страны. Агрегация эритроцитов отражает состояние клеточных мембран всего организма в целом, поэтому исследование ее показателей на фоне артериальной гипертонии имеет важное диагностическое значение [3].

Изучение биологических структур, обладающих собственной или индуцированной люминесценцией, основанное на различиях в характеристиках свечения тканей в зависимости от физиологического состояния организма, является актуальной задачей, так как позволяет диагностировать данные состояния.

Новизна данной работы заключается в том, что исследование биохемилюминесценции крови и ее корреляции с агрегацией эритроцитов человека, как дополнительных диагностических характеристик, интегрированных в общий анализ состояния крови человека, до настоящего времени не проводилось. Данная работа позволит расширить диапазон методов, используемых биологической практикой в исследовательской деятельности.

В перспективе метод биохемилюминесценции будет использован для более глубокого изучения реологических свойств крови, которые являются отражением функционального состояния организма в целом. Это позволит расширить и оптимизировать процесс исследования.

Цель данной работы – оценить характер люминол-зависимой биохемилюминесценции цельной крови человека в норме и при патологии на примере артериальной гипертонии и проследить его взаимосвязь с уровнем агрегации эритроцитов. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить различия в люминол-зависимой люминесценции цельной крови здоровых людей и больных артериальной гипертонией.

2. Оценить влияние перекиси водорода как активатора люминесценции и сравнить характер люминол-зависимой биохемилюминесценции, индуцированной перекисью водорода, крови здоровых людей и больных артериальной гипертонией.

3. Оценить различия в уровне агрегации эритроцитов здоровых людей и людей больных артериальной гипертонией.

4. Провести корреляционный анализ между люминол-зависимой биохемилюминесценции и агрегации эритроцитов крови здоровых людей и людей больных артериальной гипертонией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе в качестве объекта исследования использовалась цельная кровь здоровых людей и людей больных артериальной гипертонией. Кровь в объеме 75 мкл вносили в кювету с 2 мл люминола в физиологическом растворе NaCl 0,9н.

Максимальная концентрация люминола в растворе при 20⁰ С равна 8 ^. 10^-4 М (0,14 г/л). Раствор люминола готовился заранее путем разбавления до его максимально возможной концентрации. В качестве контроля для измерения фонового свечения использовали раствор люминола в физиологическом растворе NaCl 0,9н. Для изучения влияния перекиси водорода как активатора свечения в кювету вносили 5 мкл Н₂О₂ 3%. Измерение интенсивности биохемилюминесценции проводилось при помощи прибора «Биохемилюминометр БХЛ 3606М». По полученным данным рассчитывалась светосумма за 10 минут. Была проведена статистическая обработка результатов по стандартной схеме.

Измерение агрегации эритроцитов проводилась путем регистрации интенсивности света, рассеянного от слоя крови в ячейке Куэтта при помощи агрегометра ma1, принцип работы которого основан на методе Schmidt-Schönbein. Кровь в объеме 20 мкл помещалась между пластинами прибора. Время измерения агрегации составляло 5с. Измерение точки полудезагрегации проводилось в двух режимах: m и m1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы была изучена методика проведения измерений собственного свечения крови с помощью биохемилюминометра и определены оптимальные настройки прибора, соответствующие задачам наших исследований.

На следующем этапе работы были проведены измерения уровня биохемилюминесценции крови здоровых людей и людей больных артериальной гипертонией. Для определения истинного содержания свободных радикалов в крови необходимо использовать активаторы люминесценции. В данной работе в качестве активатора использовался люминол. Было зафиксировано достоверное увеличение уровня биохемилюминесценции крови людей больных артериальной гипертонией по сравнению с уровнем биохемилюминесценции крови здоровых людей. При этом наблюдалось свечение крови здоровых людей в интервале светосуммы 100-550 * 10³ условных единиц со средним значением 280,157± 27,185 * 10³ условных единицы, а свечение крови больных артериальной гипертонией наблюдалось в интервале светосуммы 400-100*10³ условных единицы со средним значением 713,119± 27,403*10³ условных единицы.

Увеличение уровня биохемилюминесценции при артериальной гипертонии объясняется тем, что в развитии данного заболевания большое значение приобретает неконтролируемая генерация пероксидов. Исходная активация свободнорадикальных процессов при артериальной гипертонии обусловлена снижением активности естественных антиоксидантных ферментов и дефицитом природных антиоксидантов, а также наличием дислипидемии, при которой содержащиеся в высокой концентрации в крови атерогенные липиды служат легким субстратом для перекисного окисления.

На следующем этапе работы была проведена оценка влияния перекиси водорода как активатора биохемилюминесценции. Перекись водорода по своим свойствам является свободным радикалом.

При взаимодействии Н₂0₂ с метгемоглобином образуются радикалы-инициаторы окисления люминола, в качестве которых выступают феррил радикалы гемоглобина и гидроксильные радикалы. В присутствии люминола гидроксильный радикал вступает с ним в химическую реакцию, что приводит к яркому свечению, связанному с реакциями превращения люминола.

Также наблюдалось достоверное увеличение люминол-зависимой биохемилюминесценции крови здоровых людей и больных артериальной гипертонией под действием 5 мкл перекиси водорода 3%, что свидетельствует о возможности использования данного вещества как активатора, с помощью которого можно усилить чувствительность метода биохемилюминесценции. При этом свечение крови здоровых людей активированное перекисью водорода наблюдалось в интервале 150-600*10³ условных единиц со средним значением 407,548± 31,366 *10³.

В качестве дополнительной характеристики было проведено измерение агрегации эритроцитов. В нашем исследовании значения точки полудезагрегации эритроцитов крови здоровых людей наблюдались в интервале 3-10 условных единиц со средним значением 6,090± 0,333 у. е. в режиме m (резкая остановка излучения) и 5,835± 0,290у. е. в режиме m1 (постепенное снижение излучения до 3 с^-1). При изучении крови больных артериальной гипертонией наблюдалось достоверное снижение значений точки полудезагрегации эритроцитов (Р<0,95). Значения точки полудезагрегации наблюдались в интервале 1-7 у. е. со средним значением 3,850± 0,263 у. е. (режим m) и 3,975± 0,209 у. е. (режим m1). Снижение значений агрегации эритроцитов может быть следствием значительного повышения интенсивности процессов свободнорадикального окисления.

При проведении корреляционного анализа наблюдалась высокая отрицательная корреляция между уровнем биохемилюминесценции и значением агрегации эритроцитов. Это объясняется тем, что значения данных характеристик зависят от одних процессов, протекающих в организме, в частности от процесса свободнорадикального окисления. Уровень биохемилюминесценции прямо пропорционален концентрации свободных радикалов. При артериальной гипертонии происходит интенсификация процессов свободнорадикального окисления, в результате которых происходит изменения свойств клеток крови, состава их мембран, и как следствие изменение агрегационной способности.

Выводы:

1. При патологиях наблюдается изменение уровня биохемилюминесценции. В частности при артериальной гипертонии происходит ее повышение (уровень свечения здоровых людей составил 280,157± 27,185* 10³ у. е., а уровень свечения крови больных артериальной гипертонией – 713,119± 27,403* 10³ у. е.);

2. При воздействии 3% раствора перекиси водорода происходит увеличение уровня свечения (уровень свечения крови здоровых людей после добавления перекиси водорода составил 407,548± 31,366 * 10³ у. е., больных артериальной гипертонией – 790,201± 26,726 * 10³ у. е.);

3. При артериальной гипертонии происходит снижение уровня агрегации эритроцитов (среднее значение полудезагрегации эритроцитов крови здоровых людей составило 6,090± 0,333 (m) и 5,835± 0,290 (m1), больных артериальной гипертонией - 3,850± 0,263 (m) и 3,975± 0,209 (m1));

4. При корреляционном анализе между люминол-зависимой биохемилюминесценцией и агрегацией эритроцитов крови здоровых людей и больных артериальной гипертонией наблюдалась высокая отрицательная корреляция (R= -0,73, -0,77, -0,77).

Список литературы

1. Журавлев, А. И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике/ А. И. Журавлев, А. И. Журавлева – М.: Медицина, 1975 – 128 с.

2. Зинчук В. В. Роль кислородосвязывающих свойств крови в поддержании прооксидантно–антиоксидантного равновесия организма./ В. В. Зинчук, М. В. Борисюк // Успехи физиологических наук - 1999, т. 30, № 3, 38–48.

3. Голиков А. П. Свободнорадикальное окисление и сердечнососудистая патология./ А. П. Голиков, С. А. Бойцов, В. П. Михин, В. Ю. Полумисков// Лечащий Врач - 2003, №4

4. Кодин А. В. Динамика показателей цитоархитектоники и агрегации эритроцитов на фоне различных схем медикаментозной терапии прогрессирующей стенокардии [Электронный ресурс]: статья А. В. Кодин и др.//

Полный текст: www.rusnauka.com

5. Рощупкин, Д. И. Усиленная люминолом хемилюминесценция полиморфноядерных лейкоцитов кролика: природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола. / Д. И. Рощупкин, Н. С. Белакина, М. А. Мурина// Биофизика- 2006, том 51, вып.1- с.99-107.