*111972*

Чл.-корр. РАМН Воевода М.И., д.м.н. Кручинина М.В., д.м.н. Курилович С.А.,

ФГБУ «НИИ  терапии» СО РАМН, Новосибирск, Россия

к.х.н. Кручинин В.Н., к.т.н. Рыхлицкий С.В., к.ф.-м.н. Володин В.А.,

Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова СО РАН, Новосибирск

к.б.н. Пельтек С.Е., Кобзев В.Ф.,

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия

д.ф.-м.н. Князев Б.А., Герасимов В.В.

Институт ядерной физики им. Г. И. Будкера СО РАН, Новосибирск, Россия

Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия

Диффузная патология печени: что нового в диагностике степени фиброза?

 

Введение. В проблеме диффузной патологии печени по-прежнему актуальным остается вопрос диагностики степени фиброза, так как ранние стадии заболеваний печени обратимы [1]. Наряду с известными методами определения степени фиброза (биохимический, макроморфологический, полуколичественные и др.), продолжается поиск новых способов диагностики, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью [2].     Известно, что диффузная патология печени сопровождается изменениями в составе и структуре компонентов сыворотки крови что, в свою очередь, приводит к изменению ее оптических характеристик [3]. В последние годы оптические методы занимают особое место в биомедицинских исследованиях, благодаря высокой чувствительности,  неразрушающему и невозмущающему характеру воздействия на исследуемый объект [4].

Цель. Оценить возможности оптических методов исследования сыворотки крови у пациентов с диффузной патологией печени с различной степенью фиброза для использования в ранней диагностике.

Результаты исследования. Обследованы: 21 мужчина (35-60 лет) без признаков патологии внутренних органов и фиброза печени – первая группа (F0);  57 мужчин в возрасте от 38 до 69 лет с диффузной патологией печени, алкогольного, вирусного и смешанного генезов (37 пациентов с легким  невыраженным фиброзом – вторая группа (F1-F2), 20 – с выраженным фиброзом – третья группа (F3-F4)). У большинства больных выявлена умеренная степень гистологической, биохимической активности хронического гепатита. У обследуемых методами спектральной и сканирующей эллипсометрии, ИК-Фурье спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния света (Raman) изучены тонкие пленки, полученные из сыворотки крови центрифугированием.

Результаты исследования.

Эллипсометрическое исследование позволило установить факт достоверного увеличения показателя преломления в сочетании со снижением толщины пленки по мере нарастания фиброза (p<0,001-0,002) (см. рис.1).

Рисунок 1.   Эллипсометрические показатели у пациентов с различной степенью фиброза печени.

 

 Подобные изменения толщины могут быть связаны со снижением синтеза целого ряда соединений в печени, в том числе, белков сыворотки крови, факторов свертывания, холестерина, триглицеридов (корреляции соответственно общего белка r=0,57, p<0,02; общего холестерина r=0,56, p<0,001; триглицеридов r=0,44, p<0,01) при выраженном фиброзе. Преобладание неравномерных пленок при выраженном фиброзе, очевидно, связано с выраженностью биохимического дисбаланса в сыворотке крови при циррозе печени. Показатель преломления определяется в большей степени компонентами синдромов цитолиза (для АЛТ r=0,46, p<0,03; для АСТ r=0,41, p<0,05) и холестаза (для общего билирубина r=0,52, p<0,01; для ГГТП r=0,48, p<0,033), степень их выраженности усиливается при выраженном фиброзе [2].

Исследование пленок с помощью сканирующего эллипсометра высокого разрешения «Микроскан» показало, что пленки больного с фиброзом печени F3-F4 очень неравномерны по толщине, имеют большие разрывы по сравнению с таковыми у пациентов с F1-F2 (p<0,05) (рис. 2).

Рисунок 2. Трехмерное распределение толщин пленок по поверхности пластин, у пациентов с тяжелым F3-F4 (а) и легким F1-F2 (б) фиброзом  печени.

 

В ИК-спектрах у пациентов с выраженным фиброзом печени F3-F4 достоверно выше, чем у пациентов с F1-F2, оказались пики амид III – при 1280 см-1 и пик при 3190 см-1, отражающий  N-H структуры, что указывает на более высокую концентрацию белковых молекул со вторичной структурой в виде спирали (a-helix) (р<0,001-0,05) (рис. 3).

Напротив, у пациентов со степенью фиброза F3-F4 достоверно ниже, чем в группе F1-F2, были пики при 776, 818, 889 см-1 и 966 см-1, характерные для валентных колебаний связей С-С, С-О дезоксирибоз и фрагмента PO4- молекул нуклеиновых кислот и протеинов (р<0,02-0,05). Достоверное снижение при выраженном фиброзе продемонстрировал также ряд пиков при 1399 см-1, отражающий симметричные валентные колебания групп CH3 скелетных фрагментов молекул белков; при 1450 см-1, отражающий деформационные колебания групп CH3 липидов и белков; при 1570 см-1 (амид II); 1581, 1620 см-1 (карбонильные структуры) (р<0,01-0,05). Значимое снижение компоненты при 1635 см-1, выявляющейся при разложении сложных амидных пиков, у пациентов с фиброзом печени F3-F4 связывают со снижением количества белковых молекул со структурой в виде складчатого листа (b-sheet) (р<0,05).

Рисунок 3. ИК-спектры пленок сывороток крови пациентов в обследуемых группах.

 

В спектрах комбинационного рассеяния света образцов жидких сывороток крови в области 750-1750 см-1 наблюдаются три характерных пика поглощения: при 1005, 1157 и 1520 см-1, интенсивности которых оказались достоверно ниже при наличии фиброза F3-F4 по сравнению с F1-F2 (р<0,0058-0,02). Можно предположить, что снижение площадей вышеуказанных пиков при выраженном фиброзе связано со значительными сдвигами в обмене каротинов, переходе их в витамин А, что тесно связано с состоянием функции печени [1, 2].

Интересный экспериментальный факт, наблюдаемый в данной работе, связан с воздействием на сыворотки крови пациентов с разной степенью фиброза лазерным пучком при записи спектров Раман. У обследуемых с легким фиброзом или отсутствием такового поверхность сывороток была неоднородной, в оптический микроскоп наблюдались отдельные резко очерченные области размером менее 0,5 мкм.

Под действием лазерного излучения происходило слияние и укрупнение областей до 10 и более мкм (рис. 4 а, б). В случаях выраженного фиброза наблюдаемые области оставались практически неизменными (рис. 4 в, г). При локальном нагреве лазерным лучом сыворотки крови возможны изменения, связанные с конформационными изменениями, при более выраженных воздействиях - с денатурацией белковых молекул сыворотки крови с объединением продуктов распада в более крупные области, слияние липопротеидов под действием температуры в укрупненные кластеры. 

Рисунок 4. Оптическая микроскопия поверхности жидких сывороток крови пациентов с легким фиброзом (F1-F2) (а, б) и тяжелым фиброзом  (F3-F4) (в, г) до (а, в) и после (б, г) воздействия Ar+ лазерного пучка (514,5 нм, 2-3 мВт, 3 мин).

 

Таким образом, выявленные новые возможности оптических методов являются весьма перспективными в скрининговом неинвазивном  определении стадий заболевания при диффузной патологии печени различного генеза, определении степени фиброза, в том числе, на ранних стадиях развития.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Минобрнауки РФ (ГК №02.740.11.0556), гранта РФФИ 11-02-12171-офи-м при использовании оборудования ЦКП СЦСТИ в рамках ГК № 16.552.11.7044 и при использовании оборудования научно-образовательного комплекса НГУ «Наносистемы и современные материалы».

 

Литература:

1.     Гастроэнтерология. Национальное руководство // Под ред. Ивашкина В. Т., Лапиной Т. Л. - М.: изд. группа «ГЭОТАР-Медиа». - 2008. - 700 с.

2.     Подымова С. Д. Болезни печени. - М.: Медицина. - 1993. - 544 c.

3.     Markowitz S.D., Bertagnolli M.M. Molecular origins of cancer: molecular basis of colorectal cancer // N. Engl. J. Med. 2009. V.361. P.2449–60.

4.     Arwin H. Ellipsometry on thin organic layers of biological interest: characterization and applications // Thin Solid Films. 2000. V.377-378. P.48-56.