*113096*

И.И. Черкашина, С.Ю. Никулина, Н.И. Логвиненко, В.Н. Максимов,

М.И. Воевода, А.В. Разводовская

 

ГОУ ВПО Красноярский Государственный медицинский университет им. проф. Войно-Ясенецкого, кафедра внутренних болезней №1

У РАМН НИИ терапии СО РАМН г. Новосибирск,

НГМУ, г. Новосибирск, Россия

 

Роль полиморфных вариантов генов хемокиновых рецепторов CCR5 и CCR2 в формировании предрасположенности к БА

 

            Бронхиальная астма (БА) представляет собой мультифакториальное заболевание, в развитии которого, наряду с внешнесредовыми факторами, важную роль играет и генетическая предрасположенность. Среди большого числа генов, которые могут принимать участие в формировании предрасположенности к развитию БА, внимание привлекают гены хемокиновых рецепторов CCR5 и CCR2. Эти гены ответственны за направленную миграцию и выход из сосудистого русла в ткани иммунокомпетентных клеток [12]. Ген CCR5 занимает около 6 тыс. п.н. на хромосоме 3р21. Делеция 32 п.н. в кодирующей области гена CCR5 (del32CCR5) приводит к трансляции укороченного варианта белка, не адгезирующегося на поверхности клеток. Частота делеционного аллеля гена CCR5 составляет 15,5% - 16% в различных популяциях [5]. Сведения об ассоциации CCR5del32 с риском заболевания БА немногочисленны и противоречивы [7, 8, 17, 9, 15]. Известно, что инфильтрация тканей легких эозинофилами у больных БА ассоциирована с повышенной экспрессией хемокинов СС семейства: белков хемотаксиса лимфоцитов (MCP-3, МСP-4) и RANTES [11, 12]. Дефицит экспрессии CCR5 на клетках может снижать хемотаксический потенциал указанных хемокинов. Ряд исследований в эксперименте подтверждают, что наличие дефектного аллеля ССR5del32 может снижать риск заболевания БА [7, 8, 14].

Ген рецептора CCR2 картирован на хромосоме 3р21.3 и занимает около 8 тыс. пар нуклеотидов. Для рецептора CCR2 наиболее распространенным вариантом является нуклеотидная замена G-на-A в позиции 190, что приводит к замене аминокислоты валина на изолейцин в 64 позиции (CCR2-64I) в первичной последовательности белка-рецептора. Мутация гена приводит к экспресии функционально неполноценного белка [12]. Имеются единичные указания на то, что CCR2 и их рецепторы вовлечены в аллергическую астму, однако, окончательно роль гена рецептора ССR2 при БА не определена.

Цель исследования: Изучение роли полиморфных вариантов генов хемокиновых рецепторов CCR5 и CCR2 в формировании предрасположенности к БА.

  Материалы и методы

Исследование проведено на материале 62 русских семей больных БА (всего 232 чел.) жителей г. Красноярска. В каждой семье выделялся пробанд с верифицированной БА. В основную группу вошли 62 больных с БА и 170 их родственника I, II, III степени родства, в т.ч. 81 мужчина (34,9%) и 151 женщина (65,1%). Набор пробандов производился во время их лечения в пульмонологическом отделении МУЗ ГКБ №20.

Среди всех родственников были выделены лица с БА, с другими аллергическими заболеваниями (аллергический ринит, атопический дерматит и др.) и здоровые. Медиана возраста пробандов составила 51,0 год [43,0; 60,0], родственников с БА - 43,0 года [22,0; 62,5]. Медиана возраста родственников с аллергическими заболеваниями была 28,0 лет [19,0; 36,8], здоровых родственников - 28,0 лет [19,0; 40,0]. В дальнейшем, для решения поставленной цели, родственники с БА (28 чел.) были отнесены в группу пробандов.

Диагноз БА устанавливался в соответствии с Глобальной стратегией лечения и профилактики БА (GINA 2006, 2007) [2, 3] на основании жалоб на приступы затрудненного дыхания или приступообразный кашель, купирующиеся ингаляцией β2 - агонистов, наличия обратимой бронхиальной обструкции, подтвержденной объективными методами обследования (суточный разброс ПСВ≥20%, прирост ОФВ1≥12%). Степень тяжести и обострения БА определяли по общепринятым критериям (GINA 2006, 2007) [2, 3]. Диагноз атопического дерматита, крапивницы и аллергического ринита устанавливался на основании критериев, изложенных в национальных согласительных документах (Хаитов Р.М., 2000; ARIA, 2001) [6]. Среди наблюдавшихся больных диагностированы следующие формы БА (в соответствии с МКБ - 10): аллергическая - у 73 чел (81,1%) и неаллергическая - у 17 (18,9%). По степени тяжести БА у 28 больных (31,1%) была легкой интермиттирующей, у 12 (13,3%) легкой персистирующей, у 34 (37,8%) среднетяжелой и у 16 пациентов (17,8%) тяжелой. Среди обследованных с легким обострением БА было 12 (13,3%), среднетяжелым - 49 (54,4%), тяжелым - 9 (10,0%) и не было обострения у 20 (22,2%) человек. Средний стаж болезни составил 12,3±6,1 лет.

Всем пробандам и их родственникам было проведено клинико-инструментальное исследование по следующей программе: клинический осмотр, оценка функции внешнего дыхания (ФВД) и молекулярно-генетические исследования.

С помощью молекулярно-генетических методов исследованы полиморфные варианты генов хемокиновых рецепторов CCR5 (CCR5delta32) и CCR2 (полиморфизм V64I). ДНК выделяли по стандартной методике из лейкоцитов периферической крови. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе [1]. Молекулярно-генетические исследования проведены на базе У РАМН НИИ терапии СО РАМН (г. Новосибирск). При оценке полиморфизма генов у больных БА и их родственников в качестве контроля использовали популяционную выборку здоровых лиц, жителей г. Новосибирска, n = 464, медиана возраста - 35,0 лет [29,0; 45,0].

Различия в распределении частот аллелей и генотипов гена ССR5 между группами оценивали посредством критерия χ2. В случае четырёхпольных таблиц сопряженности сравнение выборок по частотам генотипов и аллелей применяли точный двусторонний критерий Фишера. Относительный риск (OR – odds ratio) заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как отношение шансов (ОШ) [10]. Подсчитывали ОШ для оценки ассоциации между определенными генотипами и риском развития заболевания по стандартной формуле OR=a/b × d/c, где a и b – количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и d и с – количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип. ОШ указан с 95%-ным доверительным интервалом (Confidence interval CI) [4]. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Статистическая обработка материала проводилась с использованием пакета прикладных программ «Excel», «Statistica for Windows 6.0» и «SPSS 13».

Результаты и обсуждение

При анализе результатов исследования инсерционно-делеционного полиморфизма гена CCR5 у целой выборки больных БА мы не выявили значимых отличий в распределении генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора CCR5 от популяционного контроля. Среди больных БА нами установлено повышение частоты носителей гомозиготного генотипа по распространенному аллелю (II) (86,7%±3,7 и 78,3%±2,6; р = 0,209), явное снижение частоты встречаемости носителей гетерозиготного генотипа (ID) (13,3%±3,5 и 21,3%±2,5; p = 0,092) и отсутствие носителей редкого гомозиготного генотипа (DD) в сравнении с группой контроля (табл. 1). Среди больных БА носители аллеля D гена CCR5 встречались в 1,6 раз реже, чем в группе контроля: 6,7%±1,9 (12 человек) и 11,0%±1,4 (58 человек) соответственно (ОШ = 0,567; 95% ДИ 0,302 - 1,1; р = 0,111) (табл. 1).

В то же время, показаны существенные отличия в распределении частот генотипов и аллелей по гену CCR5 у больных аллергической и неаллергической БА в сравнении с контролем (табл. 2). Среди больных аллергической БА достоверно преобладал II генотип гена CCR5 по сравнению с лицами контрольной группы (90,4%±3,5 и 78,3%±2,6; ОШ = 0,383, 95% ДИ 0,167 – 0,881; р = 0,019) и больными неаллергической БА (90,4%±3,5 и 70,6%±1,1; ОШ = 0,255; 95% ДИ 0,069 - 0,936; р = 0,030). Тогда как, у больных неаллергической БА повышена доля ID генотипа по сравнению с лицами контрольной группы (29,4%±1,0 и 21,3%±2,5; р = 0,715) и больными аллергической БА (29,4%±1,0 и 9,6%±3,3; ОШ = 0,255; 95% ДИ 0,069 - 0,936; р = 0,030) (табл. 2). У больных аллергической БА частота аллеля D была существенно ниже, (4,8%±1,8 и 11,0%±1,4; ОШ = 0,406; 95% ДИ 0,181 - 0,91; р = 0,026), а у больных неаллергической БА - несколько выше, чем в популяционном контроле (14,7±6,0 и 11,0%±1,4; ОШ = 1,391; 95% ДИ 0,518 - 3,735; р = 0,572). Но, достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей по гену CCR5 в группе больных неаллергической БА с популяционным контролем получено не было (табл. 2).

Анализ распределения генотипов полиморфизма гена CCR5 в выборке больных БА показал статистически значимую ассоциацию генотипа II с легким течением БА (табл. 3). Аллель I среди лиц с легкой астмой встречался также значительно чаще, чем в контроле (96,3%±2,1 и 89,0±1,4; ОШ=0,314; 95% ДИ 0,096 – 1,028; р=0,045).

У больных аллергической БА частота аллеля D была минимальна при легкой (6,8±2,9 и 11,0±1,4; ОШ=0,585; 95%ДИ 0,227 - 1,509; р=0,316) и среднетяжелой БА (6,2±3,5; ОШ=0,538; 95%ДИ 0,162 - 1,786; р=0,461). По мере нарастания степени тяжести болезни увеличивалась частота носителей гетерозиготного генотипа ID и аллеля D. В исследованиях М.В. Флеминг и соавт. (2005) [13] и И.А. Эткиной и соавт. (1999) [16] указана такая же тенденция.

По результатам нашего исследования, статистически значимых различий в частотах генотипов и аллелей гена хемокинового рецептора ССR5 между контрольной группой, выборкой родственников пробандов I, II и III степени родства не получено (табл. 4). Носители гетерозиготного генотипа (ID) и гомозиготного генотипа по редкому аллелю (DD) встречалась несколько чаще среди родственников с признаками атопии (25,5%±5,8), чем в группе контроля (21,7%±2,6), но статистически достоверных различий между исследуемыми группами не получено (OШ = 1,234; 95% ДИ 0,629 - 2,421; p = 0,593). Носителей аллеля D в группе родственников с аллергией было также больше, чем в контроле (13,6±3,3 и 11,0±1,4; ОШ = 0,785; 95% ДИ 0,427 - 1,443; p = 0,415). Среди здоровых родственников носители генотипов ID и DD встречались реже (14,9%±3,8), чем в контрольной группе (21,7%±2,6), но статистически достоверных различий между исследуемыми группами также не получено (OШ = 1,575; 95% ДИ 0,815 - 3,042; p = 0,216). В группе здоровых родственников и контрольной группе частота гомозиготного генотипа II достигала 85,1%±3,8 и 78,3%±2,6, соответственно. Отмечено, что носителей аллеля D в группе здоровых родственников было значительно меньше в сравнении с контролем (8,0%±2,1 и 11,0±1,4; ОШ = 0,706; 95% ДИ 0,383 -1,30; p = 0,314).

В целом, при изучении вклада полиморфизма гена CCR5 мы установили ассоциацию с развитием аллергической БА в семьях. Результаты нашего исследования позволяют сделать вывод о том, что аллель D гена хемокинового рецептора ССR5 можно рассматривать протективным фактором в отношении развития БА.

В нашем исследовании у больных БА не выявлено изменений в распределении генотипов гена CCR2 по сравнению с популяционным контролем (ОШ=0,999; 95% ДИ - 0,575-1,738; р=1,0) (табл. 5). При изучении данных по носительству аллелей V и I достоверных различий между больными БА и лицами контрольной группы выявлено также не было (ОШ=0,949; 95%ДИ 0,572 - 1,575; р=0,899) (табл. 5). Но, нами выявлены статистически достоверные различия частот аллелей в группе родственников с аллергией в сравнении с популяционной контрольной группой. Аллель 64I гена CCR2 чаще встречался в группе родственников с аллергическими заболеваниями по сравнению с контрольной группой (19,0±3,6 и 11,6±1,1; р=0,035). Показатель ОШ составил 1,77, 95% ДИ 1,07 - 2,95. Наряду с этим, наблюдалось статистически достоверное увеличение частоты генотипа V/V среди здоровых родственников по сравнению с группой родственников с аллергией (82,8%±4,0 и 67,2%±6,2, соответственно; ОШ=0,4; 95% ДИ 0,196 - 0,93; р=0,04) (табл. 6). Также выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей между группами родственников с аллергией и здоровыми родственниками. Доля носителей аллеля 64I выше в группе родственников с аллергией по сравнению с группой здоровых родственников (19,0±3,6 и 9,2±2,2, соответственно; р=0,01). Отношение шансов обнаружить носителя аллеля 64I в группе родственников с аллергией в 2,6 раза выше, чем в группе здоровых родственников (95% ДИ 1,3 - 5,4).

Таким образом, на основании этих данных можно предположить, что аллель 64I вносит определенный вклад в развитие других аллергических заболеваний. Носительство аллеля 64I является предрасполагающим фактором в отношении развития аллергии.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей I/D полиморфизма гена ССR5

среди больных бронхиальной астмой и контрольной группы

 

Контроль (n=263)

БА (n=90)

Генотипы

n

%±m

n

%±m

II

206

78,3± 2,6

78

86,7±3,7

ID

 56

21,3±2,5

12

13,3±3,5

DD

 1 

0,4±0,2

0

0

р

0,209

Аллели: I

468

89,0±1,4

168

93,3±1,9

              D

58

11,0±1,4

12

6,7±1,9

р*

0,111

ОШ; 95% ДИ ОШ

0,576; 0,302-1,1

Генотип II

206

78,3 ±2,6

78

86,7±3,6

Генотипы ID+DD

 57

21,7 ±2,6

12

13,3±3,6

р*

0,092

ОШ; 95% ДИ ОШ

1,799; 0,916-3,532

Примечание: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля; р*- уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера;

 

                                                                                                Таблица 2

Распределение частот генотипов и аллелей гена CCR5 у больных бронхиальной астмой и контрольной группы

 

Контрольная группа (n=263)

Аллергическая БА (n=73)

Неаллергическая БА (n=17)

Генотипы

n

%±m

n

%±m

n

%±m

II

206

78,3± 2,6

66

90,4±3,5

12

70,6±1,1

ID

 56

21,3±2,5

 7

9,6±3,3

 5

29,4±1,0

DD

   1 

0,4±0,2

-

-

-

-

р

 

0,064

0,715

Аллели: I

468

89,0±1,4

139

95,2±1,8

29

85,3±6,0

D

58

11,0±1,4

7

4,8±1,8

5

14,7±6,0

р*

 

0,026**

0,572

ОШ; 95% ДИ ОШ

 

0,406; 0,181-0,91

1,391; 0,518-3,735

Генотип   II

206

78,3 ±2,6

66

90,4±3,4

12

70,6±1,0

Генотипы ID+DD

57

21,7 ±2,6

7

9,6±3,4

5

29,4±1,0

р*

 

0,019**

0,545

ОШ; 95% ДИ ОШ

 

0,383; 0,167-0,881

1,506; 0,509-4,451

Примечание: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля; р*- уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера; ** - достигнутый уровень значимости при сравнении частоты генотипов и аллелей с показателями группы контроля

 

 

 

    

 

 

                                                                                                           Таблица 3

Распределение генотипов и частот аллелей гена ССR5 среди больных   бронхиальной астмой разной степени тяжести и контрольной группы

Генотипы

Контроль (n=263)  %±m (n)

Легкая БА  (n=40)  %±m (n)

Средняя БА   (n=34)  %±m (n)

Тяжелая  БА (n=16)   %±m (n)

II

78,3± 2,6(206)

 92,5±4,3(37)

 82,4±6,6(28)

  81,3±9,8(13)

ID

21,3±2,5(56)

 7,5±4,0(3)

     17,6±6,4(6)

18,7±9,6(3)

DD

0,4±0,2(1)

-

-

-

р

 

0,110

0,826

0,940

Аллели

I

89,0±1,4(468)

 96,3±2,2(77)

 91,2±3,5(62)

 90,6±5,2(29)

D

 11,0±1,4(58)

 3,7±1,9(3)

 8,8±3,3(6)

 9,4±5,0(3)

 р*

 

0,045**

0,682

1,0

 ОШ, 95%ДИ ОШ

 

0,314; 0,096-1,028

0,781; 0,323-1,885

0,835; 0,247-2,826

 Генотип  II

78,3 ±2,6(206)

92,5±4,3(37)

82,4±6,6(28)

  81,3±9,8(13)

 Генотипы ID+DD

21,7 ±2,5(57)

 7,5±4,0(3)

     17,6±6,4(6)

18,7±9,6(3)

р*

 

0,034**

0,663

1,0

ОШ; 95%ДИ ОШ

 

0,293; 0,087-0,985

0,774; 0,306-1,961

0,834; 0,23-3,027

   Примечание: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля; р*- уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера; ** - достигнутый уровень значимости при сравнении частоты генотипов и аллелей с показателями группы контроля  

                                                                                               Таблица 4

Распределение частот генотипов и аллелей I/D полиморфизма гена

ССR5 среди родственников больных бронхиальной астмой

Генотипы

Контроль

%±m (n=263)

Родственники с др.

проявлениями аллергии

%±m (n=55)

Здоровые родственники

%±m (n=87)

II

78,3±2,6(206)

74,5±5,9(41)

85,1±3,8(74)

ID

21,3±2,5(56)

23,6±5,7(13)

13,8±3,6(12)

DD

0,4±0,2(1)

1,8±0,6(1)

1,1±0,3(1)

p

 

0,429

0,230

Аллели:I

89,0±1,4(468)

86,4±3,3 (95)

92,0±2,1(160)

             D

11,0±1,4(58)

13,6±3,3(15)

8,0 ±2,1(14)

р*

 

0,415

0,314

ОШ; 95% ДИ ОШ

 

0,785; 0,427-1,443

0,706; 0,383-1,30

Генотип II

78,3±2,6(206)

74,5±5,4(41)

85,1±3,8(74)

Генотипы ID+DD

21,7±2,6(57)

25,5±5,4(14)

14,9±3,8(13)

р*

 

0,593

0,216

ОШ; 95% ДИ ОШ

 

1,234; 0,629-2,421

1,575; 0,815-3,042

Примечание: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля; р* - уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера

 

Таблица 5

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма гена ССR2 у больных бронхиальной астмой и контрольной группы

 

Контроль (n=464)

Больные БА (n=90)

Генотипы

n

%±m

n

%±m

64V/ V

366

78,9±1,9

71

78,9±4,4

64V/ I

  88

19,0±1,8

18

20,0±4,2

64I/ I

 10

 2,1±1,4

 1

 1,1±1,0

 р

0,796

Аллели: V

820

88,4±1,1

160

88,9±2,4

                I

108

11,6±1,1

  20

11,1±2,4

 р*

0,899

ОШ;  95% ДИ ОШ

0,949; 0,572-1,575

Генотип   64V/64V

366

78,9±1,9

 71

78,9±4,3

Генотипы V/I+I/I

 98

21,1±1,9

 19

21,1±4,3

р*

1,0

ОШ; 95% ДИ ОШ

0,999; 0,575-1,738

Примечание: р - уровень значимости при сравнении распределения генотипов с показателями группы контроля; р* - уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера

Таблица 6

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма гена ССR2 среди родственников

Аллели

Родственники с внелегочными аллергическими заболеваниями % ±m (n=58)

Здоровые родственники % ±m (n=87)

V

81,0±3,6(94)

90,8±2,2(158)

I

19,0±3,6(22)

9,2±2,2(16) 

р

0,01*

ОШ; 95% ДИ ОШ

0,379; 0,185-0,776

Генотип  64V/V

67,2±6,2(39)

82,8±4,0(72)

Генотипы 64V/I+64I/I

32,8±6,2(19)

17,2±4,0(15)

р

0,04**

ОШ; 95% ДИ ОШ

0,428; 0,196-0,934

Примечание: р – уровень значимости, достигнутый точным критерием Фишера;

* - достигнутый уровень значимости при сравнении частоты аллелей; 

** - достигнутый уровень значимости при сравнении частоты генотипов

 

Литература

 

1.                   Воевода М.И., Устинов С.Н., Юдин Н.С. и др. Связь полиморфизма гена хемокинового рецептора CCR2 с инфарктом миокарда // Докл. АН. - 2002.- Т. 385, №2. - С. 279 - 282.

2.                   Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA) / под ред. А.Г. Чучалина. - М.: Атмосфера, 2006. - 103 с.

3.                   Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA) / под ред. А.Г. Чучалина. - М.: Атмосфера, 2007. - 107 с.

4.                   Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 351 с.

5.                   Лимбовская С.А., Хуснутдинова Э.К., Балановская Е.В. Этногеномика и геногеография народов Восточной Европы. - М.: Наука, 2002. - 261 с.

6.                   Медицинские стандарты (протоколы) диагностики и лечения больных с аллергическими заболеваниями и нарушениями иммунной системы / под ред. Р. М. Хаитова. - М.: Инсофт, 2000. - 119 с.

7.                   Флеминг М.В., Ледовская Н.Н., Гервас П.А. и др. Ассоциация полиморфизма гена CCR5 с риском заболевания бронхиальной астмой // Сборник статей по материалам шестого конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». Томск. – 2005. – С. 27.

8.                   Эткина И.А., Хуснутдинова Э.К., Карунас А.С. и др. Генетические аспекты бронхиальной астмы у детей // Здравоохранение Башкортостана.- 1999. - №6. - С. 69 – 80.

9.                   Barta J., Sharma M., Chatterjee R. et al. CCR5{delta}-32 deletion and atopic asthma in India // Thorax. - 2005. - V. 60, №1. - P. 85.

10.               10Bland J.M., Altman D.G. Statistics notes // Br. Med. J. - 2000. - V. 320, №7247. - P. 1468.

11.               Cambadiere C., Ahuja S.K., Tiffany H.L., Murphy P.M. Cloning and functional expressijn of CC CCR5, a human monocyte CC hemokine receptor selective for MIP1α, MIP1β, and RANTES // J. Leukoc. Biol. - 1996. - V. 60. - P.147 - 152.

12.            Frade J.M., Melado M., del Real G. et al. Characterization of the CCR2 chemokine receptor: Functional CCR2 receptor expression in B cells // J.Immunol.-1997. - V. 159. - P. 5576 - 5584.

13.               Ginnis R. Mc., Child F, Clayton S. et al. Further support for the association of CCR5 allelis variants with asthma susceptibility // Eur. J. Immunogenet.-2002. - V. 29, №6. - P. 525 - 528.

14.               Schuh S.M., Blease K., Hogaboam C.M. The role of CC chemokine receptor 5 (CCR5) and RANTES/CCR5 during chronic fungan asthma in mice // FASEB J. - 2002. - V. 16, №2. - P.228 - 230.

15.               Srivastava P., Helms P.J., Stevart D. et al. Association of CCR5del32 with reduced risk of childhood but not adult asthma/ // Thorax. - 2003. - V. 58. - P. 222 - 226.