Роль mTOR сигнальной системы регуляция клеточных функций

Биологические науки/5. Молекулярная биология

Булгакова О.В., Берсимбай Р.И.

Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, Астана, 010008,Казахстан

Роль mTOR сигнальной системы регуляция клеточных функций

Проведенные нами эксперименты (рис. 1 В, С) продемонстрировали как уменьшение количества клеток, вследствие апоптоза, так и изменение формы и клеточных размеров по сравнению с контролем (рис. 1 А). Причиной последнего эффекта является ингибирование сигнального пути, опосредованного действием факторов роста, прежде всего инсулино подобного фактора роста (IGF), ключевым регулятором которого является Akt.

$E:\Olga2\11.23.10.gr\Luci-2.tif$ $E:\Olga2\11.23.10.gr\T109-1.tif$

А В

C $F:\Olga2\T109-211.23.10.tif$

Рисунок 1 - Морфология клеток линии MDA-MB-435 (Olympus BX61, увеличение 10Х) (А) контроль Luciferase (B) нокдаун mTOR и линии НЕК 293 Т (С) нокдаун mTOR

Для активации Akt необходимо фосфорилирование данной киназы по двум сайтам – Thr308 и Ser437 [1-3]. Фосфорилирование Akt по остатку тирозина Thr308 осуществляется PDK1, по сайту Ser437 Akt фосфорилирует mTORC2. Нокдаун mTOR приводит к нарушению формирования второго комплекса и как следствие снижение активности Akt. Вестерн-блотинг с применением pAkt437 антител выявил ингибирование фосфорилирования Akt в клетках, где наблюдается сайленсинг mTOR (рис.2).

Рисунок 2 - Вестерн-блот иммунопреципитатов полученных из клетоной линии HEK 293T (контроль и mTOR нокдаун) с применением mTOR, tubulin, pAkt437 антител.

Все выше изложенное подтверждает, что mTOR сигналинг регулирует рост и размер клеток путем активации биосинтеза белков. Однако данный факт широко известен в научной литературе. Но так как mTOR функционирует в составе, по крайней мере, двух известных на данный момент комплексов возникает закономерный вопрос, какой из компонентов выше названных комплексов (или комплекс в целом) играет существенную роль в клеточной пролиферации. Для того чтобы найти ответ на этот вопрос нами был проведен ряд эксперементов, целью которых являлось ингибирование mTOR сигнальной системы двумя различными ингибиторами - рапамицином и торином 1. Хотелось бы подчеркнуть, что выше названные ингибиторы имеют в основе своего действия различный механизм.

Как известно комплекс FKBP12 – рапамицин дестабилизирует mTORC1 ослабляя присоединение белка раптора к mTOR, и как следствие происходит снижение уровня фосфорилирования основных субстратов mTORC1 – S6K1 (рис. 3) и 4E-BP.

Рисунок 3 - Ингибирование рапамицином (клеточная линия НЕК 293Т, концентрация 10 nM, 50 nM, экспозиция 10 минут, в качестве контроля (Con)- DMSO; для вестерн-блотинга использовались pS6K1 (Thr 389) антитела).

Торин 1 в отличие от рапамицина не является аллостерическим игибитором, и как свидетельствует ряд исследователей, даный ингибитор полностью подавляет активность как так mTORC 1 и mTORC2 [150].

Согласно полученным результатам, хотя рапамицин-обусловленное ингибирование и приводит к незначительному снижению клеточной пролиферации, (рис.4 В), торин 1 обладает более выраженным эффектом (рис.4 С и 4 А) и если представить экспериментальные данные в графическом варианте, то можно проследить четкую обратнопропорциональную зависимость между количеством клеток и ингибирующим действием торина 1 (рис. 4 D). Как уже было сказано клетки подвеергшиеся обработке рапамицином хотя и замедляют свой рост, но не прекащают его полностью (рис. 4 В), в то время как воздействие торина 1 приводит к полной остановке клеточной пролиферации (рис. 4 С и D). Более того торин 1 вызывает также и уменьшение размера клеток. Так как в случае рапамицина речь идет об ингибировании активности mTORC1, то нами было выдвинуто предположение, что выше описанные эффекты торина 1 обусловлены воздействием последнего на mTORC2.

$F:\Olga2\Luci2.11.23.10.tif$ $F:\Olga2\12.14.10 ran bp kd\3305.jpg$

В С

Рисунок 4 – Ингибирование mTORC1 (А) – результаты иммуноблотинга (использвались рапамицин ( Rap) в концентрации 10 nM и торин (Torin) – 50 nM, экспозиция составила 3 часа и 24 часа, контролем (C) являлся DMSO) ; (В)- морфология клеток НЕК 293 Т после 24 часовой инкубации с рапамцином; (С) – морфология клеток НЕК 293 Т после 24 часовой инкубации с торином 1; (D) – сравнительный анализ клеточной пролиферации в контроле, после обработки рапамицином и торином 1 (клеточная линия HEK 293 T, пассаж клеток 3.5х 10⁶, экспозиция 24 часа).

Однако при анализе литературных данных (Thoreen и Sabatini), мы выяснили, что обработка клеток линии MEF Rictor -/- (нокаутных по гену риктора) торином 1 имела выраженный антипролиферативный эффект. Что было подтверждено и результатами наших экспериментов.

Таким образом, выше изложенные факты позволяют нам сделать вывод, что именно mTOR (а не раптор или риктор) играет основную роль в пролиферации клеток .

ЛИТЕРАТУРА

1. Copp, J., Manning, G., and Hunter, T. (2009). TORC-specific phosphorylation of mammalian target of rapamycin (mTOR): phospho-Ser2481 is a marker for intact mTOR signaling complex 2. Cancer Res 69, 1821-1827.

2. Frias, M.A., Thoreen, C.C., Jaffe, J.D., Schroder, W., Sculley, T., Carr, S.A., and Sabatini, D.M. (2006). mSin1 is necessary for Akt/PKB phosphorylation, and its isoforms define three distinct mTORC2s. Curr Biol 16, 1865-1870.

3. Ikenoue, T., Inoki, K., Yang, Q., Zhou, X., and Guan, K.L. (2008). Essential function of TORC2 in PKC and Akt turn motif phosphorylation, maturation and signalling. EMBO J 27, 1919-1931.