К.б.н. Квач С.В., к.б.н. Ерошевская Л.А., д.б.н. Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

генно-инженерное конструирование штамма-продуцента бактериальной аденозиндезаминазы

Микроорганизмы служат ценнейшим источником ферментов для промышленных, медицинских и исследовательских целей. Одним из ферментов, играющих важную роль в метаболизме пуриновых нуклеозидов является аденозиндезаминаза (ЕС 3.5.4.4). Этот фермент осуществляет необратимую реакцию превращения аденозина в инозин путем отщепления аминогруппы от гетероциклического основания нуклеозида. Помимо своего основного субстрата – аденозина, аденозиндезаминаза Escherichia coli может использовать ряд других нуклеозидов – 2′-дезоксиаденозин, 3′-дезоксиаденозин, 2′,3′-дидезоксиаденозин, 2-амино-6-метилпуринрибозид, 2,6-диаминопуринрибозид, аденинарабинозид [1,2]. Способность фермента осуществлять дезаминирование модифицированных пуриновых нуклеозидов делает его привлекательным для использования в химико-ферментативных схемах получения различных субстанций с потенциальной фармакологической активностью.

Целью настоящего исследования явилось создание штамма-суперпродуцента аденозиндезаминазы E. coli.

Объекты и методы исследования. Объектом исследований служил коллекционный штамм E. coli БМТ-4Д/1а – донор гена, кодирующего аденозиндезаминазу, штамм E. coli BL21(DE3), использующийся в качестве акцептора рекомбинантного вектора, несущего ген денозиндезаминазы, и штамм E. coli DH5α, служащий промежуточным хозяином для наработки и анализа рекомбинантного вектора.

Культивирование всех штаммов проводилось при 37^oС на стандартной среде LB (рН 7,2), содержащей: 10 г/л триптона, 10 г/л NaCl и 5 г/л дрожжевого экстракта. Штаммы, содержащие плазмиды и векторы на их основе, культивировались на среде с канамицином в концентрации 50 мкг/мл.

Клетки E. coli BL21(DE3), несущие плазмиду с геном аденозиндезаминазы, выращивали на LB-среде до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм), затем проводили индукцию синтеза белка путем внесения IPTG до концентрации 1 мМ и продолжали культивирование в течение 24 ч. После добавления индуктора через равные промежутки времени отбирали по 1 мл культуры и определяли выход биомассы и аденозиндезаминазную активность клеток.

Выделение геномной ДНК проводили фенол-хлороформенным методом с дополнительной очисткой при помощи цетавлона [3].

Подбор праймеров для ПЦР проводили, используя данные о первичной структуре гена аденозиндезаминазы. На 5′-концах праймеров были встроены сайты рестрикции NdeI и BamHI, дополненные 6-тью и 2-мя произвольными нуклеотидами. Реакцию ПЦР проводили в буфере, содержащем 67 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 17 мМ (NH₄)₂SO₄, 3 мМ MgCl₂, 0,1% Твин-20, 0,12 мг/мл БСА, 8% глицерин, с добавлением каждого из четырех природных дезоксинуклеозидтрифосфатов в концентрации 0,02 мM, каждого из праймеров (GCCCGACATATGATTGATACCACCCTGCCA и CGGGATCCCG-TTACTTCGCGGCGACTTTTTC) в концентрации 0,2 мкМ, 150–200 нг тотальной ДНК E. coli БМT-4Д/1а и 1 ед. активности Taq-полимеразы. Амплификация выполнялась по программе: начальная денатурация (5 мин 94^оС), 25 циклов амплификации (30 с 94^оС + 30 с 61^оС + 1 мин 72^оС), заключительная элонгация (7 мин 72^оС). Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену аденозиндезаминазы, выделяли и лигировали в вектор pET24b+, также рестрицированный по NdeI и BamHI и обработанный щелочной фосфатазой.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), проводили по методу Лэммли [4]. Белковые препараты солюбилизировали добавлением буфера (в соотношении 1:1) следующего состава: 0,125 М Трис-НCl (рН 6,8); 4% ДСН; 20% глицерин; 0,2 М дитиотреитол. Для денатурации белков пробы кипятили в течение 5 мин. По окончании электрофореза белки окрашивали при помощи красителя Кумасси G-250.

Активность аденозиндезаминазы определяли по скорости дезаминирования аденозина. Реакционную смесь, содержащую 50 мМ аденозин, 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,0) и 0,004% клетки (из расчета на сухую биомассу), инкубировали при 37^оС в течение 15 мин. Из анализируемых образцов отбирали аликвоты (5 мкл), которые наносили на хроматографические пластины для тонкослойной хроматографии Silufol-UV₂₅₄. Хроматографию проводили в системе растворителей изопропанол–хлороформ–25%-аммиак (10:10:1; об/об). Расположение пятен субстратов и продуктов реакции определяли в УФ-свете. Вещества элюировали 5 мл 5 мМ K-фосфатного буфера (рН 7,0). УФ-светопоглощение элюатов измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны λ=250 нм. Активность фермента определяли на начальной стадии реакции, когда выход продукта не превышал 10–15% от максимального. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое обеспечивало образование 1 мкмоль продукта за 1 мин в соответствующих условиях реакции. Активность фермента выражали в ед/мл культуральной жидкости и ед/мг сухой биомассы клеток.

Результаты и их обсуждение. Ген add, кодирующий аденозиндезаминазу E. сoli, был изолирован из геномной ДНК с использованием ПЦР и встроен в плазмиду pET24b+ (Novagen, США) под контролем Т7-промотора (сильного промотора 10-го гена капсида фага Т7). Полученной плазмидой трансформировали клетки E. coli BL21(DE3), предназначенные для экспрессии белка, находящегося под контролем T7-промотора. Полученный штамм был назван E. coli:pADD3. На первом этапе провели выращивание штамма E. coli:pADD3 и индукцию синтеза аденозиндезаминазы согласно рекомендациям фирмы-производителя. Клетки выращивали до оптической плотности 0,6, затем в среду вносили индуктор и продолжали культивирование в течение 3-х ч. Для визуального контроля синтеза целевого белка проводили ДСН-полиакриламидный электрофорез белков, результаты которого представлены на рис. 1.

Рис. 1 – Электрофореграмма белков клеток E. coli:pADD3 при индукции экспрессии при помощи IPTG.

А – клетки, индуцированные IPTG в течение 3 ч; М – маркерные белки.

Из электрофореграммы видно, что через 3 ч индукции нарабатывается белок, составляющий большую часть общего растворимого клеточного белка.

На следующем этапе работы была изучена динамика накопления фермента от длительности индукции. Результаты представлены на рис. 2.

Рис. 2 − Динамика накопления в среде биомассы (1;Х) и аденозиндезаминазы (2;Е) при индукции экспрессии белка в штамме E. coli:pADD3

Изучение характера роста клеток E. coli:pADD3 и биосинтеза ими аденозиндезаминазы при индукции 1 мМ IPTG в динамике показало, что максимальный уровень накопления фермента (47,3 ед/мг) достигается через 7 ч после начала индукции (10 ч после начала культивирования). При дальнейшем культивировании активность падает и к 24 ч составляет 40% от максимальной. По нашему мнению это может быть связано с потерей клетками вектора и, как следствие, размножением бесплазмидных клеток, неспособных экспрессировать целевой белок.

Заключение. Проведена амплификация гена аденозиндезаминазы из геномной ДНК E. coli. Выделенный ген клонирован в плазмиду pET24b+. Получен новый генно-инженерный штамм E. coli:pADD3 – суперпродуцент аденозиндезаминазы. Продуцируемая штаммом E. coli:pADD3 аденозиндезаминаза представлена активным водорастворимым белком.

Изучена динамика накопления фермента при индукции экспрессии с помощью 1 мМ IPTG. Показано, что максимальный уровень продукции фермента (47,3 ед/мг) достигается на 7 ч индукции.

Работа выполнена в рамках ГППИ «Новые биотехнологии».

Литература:

1. Nygaard, P. Adenosine deaminase from Escherichia coli / P. Nygaard // Methods Enzymol. – 1978. – Vol. 51. – P. 508–512.

2. Okuyama, K. Enzymatic synthesis of 2′-deoxyguanosine with nucleoside deoxyribosyltransferase-II / K. Okuyama, S. Shibuya, T. Hamamoto, T. Noguchi // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2003. – Vol. 67, № 5. – P. 989–995.

3. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. Frittsch, T. Maniatis. – 2-nd ed.– New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 2222 p.

4. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 259. – P. 680–685.