Біологічні науки/Мікробіологія

Дрегваль О.А., Тюркіна А.Ю., Черевач Н.В., Вінніков А.І.

Дніпропетровський національний університет ім. О. Гончара, Україна

ВИВЧЕННЯ ТОКСИГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ РІЗНИХ ШТАМІВ BACILLUS THURINGIENSIS

Найбільш відомими бактеріями, що використовуються для боротьби з комахами-шкідниками, є Bacillus thuringiensis. Загальновідомі біопрепарати на основі цих бактерій містять спори, кристалічні включення та β-екзотоксин, але деякі дослідники вважають, що більш доцільним і безпечним у використанні є ізольовані токсини [1]. Найбільш перспективним для розробки препаратів на основі очищених токсинів є ендотоксин кристалічних включень, який характеризується, як правило, вузькою специфічністю, тобто токсичністю для обмеженого кола комах та безпечністю для хребетних. Ендотоксин потребує активації, оскільки виробляється бактеріями у формі протоксину [2, 3]. Існують дані про підсилення токсичності кристалічних включень для деяких видів комах після розчинення і обробки трипсином. Це пов’язано з тим, що умови кишечнику таких комах не сприятливі для перетворення протоксина на активну форму, яка зв’язується з рецепторами кишечнику [3, 4].

Виходячи з вищесказаного, метою даної роботи було вивчення токсигенних властивостей штамів бактерій B. thuringiensis. В задачі роботи входило дослідження впливу β-екзотоксину та δ-ендотоксину штамів B. thuringiensis (В-2, В-10, В-14) із колекції культур мікроорганізмів кафедри мікробіології та вірусології ДНУ на личинок гнойової мухи (Haematobia serra); дослідження впливу обробки трипсином δ-ендотоксину штамів B. thuringiensis на інсектицидну активність проти личинок гнойової мухи та листокрутки всеїдної (Archips podana); дослідження інсектицидної активності різних білкових фракцій δ-ендотоксину B. thuringiensis до та після трипсинізації проти личинок листокрутки всеїдної.

Перевірка інсектицидної активності токсинів штамів B. thuringiensis проти личинок гнойової мухи показала, що найбільш токсичним виявився штам В-14, біологічна активність ендотоксину, отриманого від цього штаму складала 81 % загибелі личинок, від дії екзотоксину загибель складала 58 % (рис. 1).

Рис. 1. Порівняння біологічної активності різних токсинів штамів B. thuringiensis по відношенню до личинок Haematobia serra – гнойової мухи

Штам В-10 показав помірну активність ендотоксину (68 %) та низьку (29 %) екзотоксину. Штам В-2 показав низьку активність ендотоксину (39 %) та середню активність екзотоксину (52 %). Трипсинізація підвищила інсектицидну активність ендотоксину до мух лише у випадку обробки розчинених у лужному середовищі кристалів штаму В-2 (із 39 до 45 %), знизила токсичність ендотоксину штаму В-10 (із 68 до 29 %) та не змінила токсичність у випадку штаму В-14 (81 та 81 %, до і після обробки трипсином відповідно), яка все-таки залишилась високою. Таким чином, можна зробити висновок щодо недоцільності трипсинізації ендотоксину при застосуванні його проти личинок гнойової мухи.

Дослідження інсектицидної активності проти листокрутки всеїдної (представника ряду Lepidoptera) показало, що ендотоксини досліджуваних штамів В-2 та В-10 були майже однаково ефективні – 47 % та 43 % загибелі відповідно. Штам В-14 показав низьку активність ендотоксину – 23 % загибелі. Обробка ендотоксинів штамів В-2 та В-10 трипсином привела до зниження токсичності (із 47 % до 20 % у випадку штаму В-2), або не змінила (43 % до та після обробки відповідно у випадку штаму В-10). Лише при обробці трипсином ендотоксину штаму В-14 його збільшилася від 23 % до 53 % (рис.2).

Рис. 2. Порівняння інсектицидної активності штамів B. thuringiensis проти личинок Archips podana – листокрутки всеїдної

Фракціонування білкового ендотоксину штаму В-14 за допомогою гель-хроматографії на сефадексі G 50 з використанням 0,05 М карбонатно-бікарбонатного буферу показало, що профіль елюції до трипсинізації та після був подібний (рис. 3). Якщо порівнювати концентрацію білка у фракціях до та після трипсинізації, то потрібно зазначити збільшення оптичної густини після трипсинізації. Ймовірно, це пов’язано з тим, що у фракціях з 2 по 16 збільшення оптичної густини відбувається за рахунок трипсину, тоді як у наступних фракціях це відбувається за рахунок збільшення кількості білків, які утворилися під дією трипсину з високомолекулярних білків.

Рис. 3 Профіль елюції розчиненого у лужному середовищі ендотоксину штаму B. thuringiensis В-14 до та після обробки трипсином

При дослідженні токсичності окремих фракцій ендотоксину штаму В-14 було виявлено, що активність першої групи фракцій (2-16) в результаті обробки трипсином збільшилась з 40 до 57 % загибелі (табл. 1).

Таблиця 1

Інсектицидна активність фракцій B. thuringiensis штаму В-14 проти личинок Archips podana – листокрутки всеїдної

Токсин	№ фракцій	% загибелі
Ендотоксин	2-15	40
	16-22	47
	26-32	33
Ендотоксин трипсинізованний	2-16	57
	17-20	33
	29-33	30

Активність інших груп фракцій після трипсинізації зменшилась. Як було відмічено раніше, загальна ефективність ендотоксину після трипсинізації збільшилась. Ймовірно це відбулося за рахунок збільшення білків із середньою молекулярною масою в результаті розщеплення високомолекулярних білків.

Таким чином, встановлено, що трипсинізація δ-ендотоксину штаму В-14 на 30 % підвищила його активність проти личинок листокрутки всеїдної. Обробка трипсином δ-ендотоксинів усіх досліджених штамів не призвела до збільшення їх активності по відношенню до личинок гнойової мухи.

Література:

1. Каменек Л.К. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: механизм действия и препараты на его основе / Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии Материалы II Международной научно-практической конференции. Казань, 15-16 сентября 2008 г. Казань, 2008. - С.48 - 49.

2. Crickmore N. Beyond the spore - past and future developments of Bacillus thuringiensis as a biopesticide // Journal of Applied Microbiology. – 2006. – Vol. 101, № 3. – P. 616 – 619.

3. Римар С.Ю., Ісакова І.А., Кузнєцова Л.М., Курдюм В.А. Гени інсектицидних кристалічних білків подвійної специфічності у штамах Bacillus thuringiensis, виділених на території Криму // Мікробіол. журн. – 2006. – Т. 68, № 5. – С. 36 – 44.

4. Naimov S., Boncheva R., Karlova R., Dukiandjiev S., Minkov S., de Maagd Ruud A. Solubilization, activation, and insecticidal activity of Bacillus thuringiensis serovar thompsoni HD542 crystal proteins // Applied and Environmental Microbiology. – 2008. – Vol. 74, № 23. – P. 7145 – 7151/