Біологічні науки/ Мікробіологія

Дрегваль О.А., Кириченко І.О., Черевач Н.В., Вінніков А.І.

Дніпропетровський національний університет ім. О. Гончара, Україна

СЕЛЕКЦІЯ ШТАМІВ ЕНТОМОПАТОГЕННИХ БАКТЕРІЙ

Захист рослин від шкідників є невід’ємною частиною сільськогосподарського виробництва, без якої неможливо отримати гарантований врожай. Екологічними перевагами мікробних препаратів над хімічними є їх висока видова специфічність по відношенню до шкідливих комах, безпечність для ентомофагів і природні механізми розщеплення відмерлих мікроорганізмів, в той час як синтетичні пестициди є чужорідними для довкілля сполуками. На відміну від хімічних, біологічні препарати є засобом не знищення, а регуляції чисельності шкідників, тобто зниження її до економічно безпечного рівня [1 – 3]. Найбільш розповсюдженим агентом мікробіологічної боротьби з комахами-шкідниками є Bacillus thuringiensis. Для ефективного виробництва біоінсектицидних препаратів необхідною умовою є використання мікроорганізмів, що характеризуються високою інсектицидною активністю, тому отримання високоактивних штамів є актуальною проблемою [4].

Виходячи з вищесказаного, метою даної роботи було підвищення патогенності штаму Bacillus thuringiensis В-10 із колекції культур мікроорганізмів кафедри мікробіології та вірусології по відношенню до цільового об’єкту – листокрутки всеїдної (Archips podana). В якості методу селекції застосовували індукований мутагенез з використанням УФ-опромінення. Опромінювали споровий матеріал. Джерелом УФ-променів слугувала лампа В 15.2 Medicor Budapest. Доза опромінення визначалась часом від 1 до 5 хвилин. Ознакою при відборі змінених варіантів слугувала морфологія колоній.

На основі підрахунку числа виживших клітин і відсотку виживання відносно неопроміненого контролю була побудована крива виживання. найбільший відсоток виживання спостерігався при опроміненні протягом 1 хвилини – 9,13%, відсоток виживання після опромінення протягом 5 хвилин становив 0,022%. Треба відмітити, що при опроміненні протягом 3 хвилин відсоток виживання був відносно високим і становив 1,5%, але саме при цьому режимі опромінення спостерігалось утворення найбільшої різноманітності морфологічних варіантів колоній. Тому для отримання змінених варіантів обрано режим опромінення тривалістю 3 хвилини.

Після 24 годин інкубації висівів із опроміненої протягом 3 хвилин суспензії на МПА отримали три морфотипи колоній Т₁, Т₂, Т₃. Опис колоній наведені у таблиці 1.

Таблиця 1

Морфологія колоній змінених варіантів штаму В-10, отриманих УФ-опроміненням

№ варіанта	Тип колонії	Опис колоній
5, 6, 7, 8	Т1	Діаметр 5-8 мм; форма округла; колір світло-сірий; краї рівні; поверхня гладка, матова; структура однорідна; профіль плаский; консистенція плівкоподібна
1, 2, 3,4	Т2	Діаметр 2-3 мм; форма округла; колір напівпрозорий, сіруватий; краї рівні; поверхня гладка, наявний маслянистий блиск; структура однорідна; профіль випуклий; консистенція пастоподібна
9, 10, 11	Т3	Діаметр 10-15 мм; форма асиметрично округла; колір жовтувато-сірий; краї ризоїдні; поверхня гладка, матова; структура дрібнозерниста; профіль плаский; консистенція пастоподібна

Для подальшої роботи було виділено по декілька варіантів опроміненого штаму, які відрізнялись за морфотипами колоній (табл. 1)

Колонії вихідного типу мали такі характеристики: округла форма, хвилястий край, щільна пастоподібна консистенція, сіруватий колір, плаский профіль, дрібнозерниста структура, матова поверхня, діаметр близько 10 мм.

У порівнянні з вихідним штамом морфотип колоній Т₁ мав деякі відмінності, серед них: менший діаметр колоній, що становив 5-8 мм, рівні краї, однорідна структура і плівкоподібна консистенція. Морфотип колоній Т₂ мав такі відмінності від вихідного штаму: набагато менший діаметр колоній, що становив 2-3 мм, напівпрозорий колір, рівні краї, наявність маслянистого блиску на поверхні колоній, однорідна структура і випуклий профіль. Колонії морфотипу Т₃ відрізнялись від колоній вихідного типу більшим діаметром, що мав розміри 10-15 мм, асиметричною формою і ризоїдними краями.

Вивчення морфологічних ознак клітин отриманих варіантів показало, що для штаму В-10 характерне розташування паличок у коротких ланцюжках по 2-4 клітини і невелика кількість спор і кристалів. Варіанти №1-4 (морфотип Т₂) мали паличкоподібні клітини розташовані по одній або у коротких ланцюжках по 3-6, розмір клітин не відрізнявся від вихідного штаму. Варіанти №5-8 (морфотип Т₁) характеризувалися меншим розміром клітин, ніж вихідний штам, клітини розташовувалися поодиноко або парами. Варіанти №9-11 (морфотип Т₃) мали клітини нерівної форми часто у вигляді чечевичок. Всі варіанти утворювали спори та кристали, але найбільша кількість кристалів була зареєстрована в культурах морфотипу Т₁. Для подальшої роботи було обрано варіант №7 (морфотип Т₁), №1 (морфотип Т₂) та №11 (морфотип Т₃). Вибір цих варіантів був зумовлений їх здатністю утворювати велику кількість спор та кристалів.

Вивчення біохімічних властивостей (ліпазної, лецитиназної, уреазної, протеолітичної активності) отриманих варіантів у порівнянні з вихідним штамом В-10 показало, що варіанти морфотипу Т₁ характеризувалися відсутністю досліджуваних ферментативних активностей. Варіанти з Т₂ типом колоній проявляли протеолітичну активність. Варіанти з Т₃ типом колоній синтезували протеїназу та лецитиназу (табл.2).

Таблиця 2

Біохімічні властивості варіантів B. thuringiensis B-10

№ варіанта	Ліпаза	Лецитиназа	Уреаза	Протеоліз казеїну
1	++	-	-	++
2	-	-	++	+
3	-	-	-	++
4	-	++	-	+
5	-	-	-	-
6	-	-	-	-
7	-	-	-	-
8	-	-	-	-
9	+	+++	-	+
10	-	++	-	+
11	-	+	-	++
В-10(Контроль)	-	++	-	++

Примітки: “ +++” - сильна реакція, “++” - помірна реакція, “+” - слабка реакція, “–“ - відсутність реакції.

З метою дослідження ентомоцидних властивостей окремих варіантів було проведено зараження личинок листокрутки всеїдної (Archips podana) IV-го віку культуральною рідиною з концентрацією 1×10⁸ спор/мл. Результати експерименту наведені в таблиці 3. Найвищу інсектицидну активність показав варіант №7, який характеризувався найбільшою продукцією кристалів порівняно з іншими варіантами та вихідним штамом. Рівень смертності досягав 86,7 %, тоді як від дії вихідного штаму та інших варіантів смерність коливалась в межах 51,1 - 55,6 % загибелі. Порівняння біохімічної та інсектицидної активностей досліджуваних варіантів не дозволило виявити помітної кореляції між цими ознаками. Так, варіант №7, що характеризувався низькою біохімічною активностю виявився найбільш вірулентним по відношенню до цільового об’єкту, а біохімічні властивості варіантів із середнім рівнем інсектицидної активності були різними.

Таблиця 3.

Інсектицидна активність варіантів штаму В. thuringiensis В-10

Штам	Загибель гусіні листокрутки всеїдної, %
	2 доби	3 доби	4 доби	7 діб	8діб
Варіант №1	11,1±1,7	24,4±1,7	35,6±1,7	44,4±1,7	53,3±2,6
Варіант №7	13,3±2,6	28,9±1,7	51,1±1,7	75,6±1,7	86,7±2,6
Варіант №11	8,9±1,7	28,9±1,7	44,4±1,7	53,3±2,6	55,6±1,7
В-10	13,3±2,	22,2±1,7	31,1±1,7	37,8±1,7	51,1±1,7
контроль	0	0	0	0	0

Таким чином в результаті проведеного мутагенезу було досягнуто підвищення інсектицидної активності вихідного штаму B. thuringiensis В-10 на 35,6 % по відношенню до листокрутки всеїдної.

Література:

1. Федоренко В.П. Биологическая защита растений: успехи, проблемы, перспективы / Федоренко В.П., Гниненко Ю.С. // Карантин і захист рослин. – 2005. – №7. – С. 1-2.

2. Патика В. П. Екологічні основи застосування біологічних засобів захисту рослин як альтернативи хімічним пестицидам / Патика В.П., Омельянець Т.Г. // Агроекологічний журнал. – 2005. - №2. – С. 21 – 23.

3. Дятлова К. Д. Микробные препараты в растениеводстве // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Том 7. - №5. – С. 17 – 22.

4. Патыка Т.И. Токсигенные свойства энтомопатогенов Bacillus thuringiensis / Патыка Т. И., Патыка В. Ф. // Мікробіологія і біотехнологія. – 2009. - №1 (5). – С. 56 – 63.