Биологические науки/9. Биохимия и биофизика.

К.б.н. Ловягина Е.Р, Чуркина Л.А., Школьников Д., к.б.н. Солнцев М.К., д.б.н. Семин Б.К.

Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова, Россия

Пути окисления экзогенных доноров в фотосистеме 2,

не содержащей марганец

В фотосинтезирующих организмах пигмент-белковый комплекс фотосистемы 2 (ФС2) осуществляет окисление воды и выделение кислорода. Этот процесс является одной из важных биоэнергетических реакций, поскольку представляет собой основной источник кислорода в атмосфере. Вследствие этого исследование фотосинтетического окисления воды имеет большое фундаментальное и технологическое значение.

Окисление воды в ФС2 осуществляется каталитическим центром – кислород выделяющим комплексом (КВК). Благодаря исследованиям последних лет стали известны многие особенности строения ФС2 и структуры КВК. Функционирование каталитического центра обеспечивает работа электрон-транспортной цепи. После поглощения кванта света вторичный донор электронов тирозин-161 белка D1 (Y_Z) передает электрон фотоокисленному первичному донору электронов Р680⁺ и, в свою очередь, окисляет Mn-кластер КВК. Источником электронов для работы КВК служат молекулы воды. В нативной ФС2 окислитель Y_Z^• недоступен для компонентов внешней среды и может окислять только КВК. При экстракции КВК (кластера Mn4-Ca и трех периферических белков, закрывающих этот кластер) из ФС2 [ФС2(-Mn)] Y_Z^• становится доступным для экзогенных доноров электронов и окисляет их с высокой эффективностью. Однако, помимо Y_Z^•-зависимого участка окисления в ФС2(-Mn) появляется еще один участок окисления экзогенных доноров (низкоаффинный). Природа окислителя на этом участке неизвестна. Существуют экспериментальные указания на то, что роль альтернативного окислителя может играть His. Логично предположить, что это – D1-His190 [Tommos & Babcock, 2000; Semin et al., 2005], расположенный вблизи Y_Z на одинаковом с ним расстоянии от Р680. Моделирование поверхности ФС2 без КВК показывает, что His190 расположен фактически на поверхности белковой глобулы. Такое положение в отсутствие КВК делает его доступным для экзогенных доноров электронов, таких как Mn(II), Fe(II), дифенилкарбазид (ДФК), гидроксиламин. Ранее было показано, что основной путь транспорта электронов через Y_Z может быть заблокирован катионами Fe [Semin et al., 1995; 2002]. В отсутствие Mn они эффективно связываются с нативными Mn-связывающими участками КВК и экранируют Y_Z от экзогенных доноров. В таких блокированных препаратах функционирует только один путь транспорта электрона – от низкоаффинного участка окисления к Р680⁺, что очень удобно для его изучения.

Информативным методом, используемым для исследования работы электрон-транспортной цепи ФС2, является метод термолюминесценции [Vass & Govindjee, 1996; Култышева и др., 2001]. При удалении марганцевого кластера на кривых высвечивания термолюминесценции появляется специфическая полоса при –18^oС, так называемая «А_Т-полоса». С применением модификаторов гистидина и карбоксильных групп установлено, что эта полоса обусловлена рекомбинацией зарядов восстановленного первичного акцептора Q^-_A и окисленного редокс-активного гистидина [Ono & Inoue, 1991].

В задачу настоящей работы входило выяснение участия остатка гистидина-190 белка D1 реакционного центра ФС2 в альтернативном переносе электрона от искусственного донора ДФК к Р680 с помощью регистрации А_Т-полосы термолюминесценции.

В результате проведенной работы установлено, что блокирование основного пути транспорта электронов через Y_Z катионами Fe в препаратах ФС2(-Mn) сопровождается ~50% подавлением А_Т-полосы термолюминесценции. Такой эффект, вероятно, обусловлен тем, что связывание катионов Fe с высокоаффинным участком (участком высокого сродства к Mn) приводит к затруднению индукции His⁺.

Модификатор гистидиновых остатков диэтилпирокарбонат (ДЕПК) в концентрации 20 мМ и выше полностью подавляет А_Т-полосу в препаратах ФС2 без Mn. При этом электронный транспорт от искусственного донора электронов ДФК через альтернативный окислитель сохраняется на 60%. Результаты с ДЕПК, на первый взгляд, указывают на то, что His не принимает участия в альтернативном транспорте. Уменьшение скорости электронного транспорта в модифицированных катионами Fe препаратах ФС2(-Mn) на 40%, видимо, носит неспецифический характер, поскольку такое же уменьшение наблюдается в контрольных экспериментах при обработке ДЕПК неблокированных железом препаратов ФС2(-Mn). Однако не исключено, что при связывании ДЕПК с His-190 (вероятным альтернативным окислителем), расположенным на расстоянии водородной связи от Y_Z, происходят пространственные изменения, приводящие к восстановлению доступности Y_Z для ДФК. В этом случае в поставленном эксперименте мы регистрировали электронный транспорт не через альтернативный окислитель, а через Y_Z.

В последующих экспериментах было показано, что увеличение концентрации искусственного донора электронов ДФК приводит к увеличению скорости электронного транспорта, что в свою очередь количественно коррелирует с уменьшением амплитуды полосы А_Т в препаратах ФС2 без Mn с блокированным с помощью катионов железа Y_Z (рис.1).

Рис. 1. Зависимость амплитуды А_Т-полосы (o) и скорости транспорта электронов ДФК-Р680-ДХФИФ (·) от концентрации ДФК в препаратах ФС2(-Mn) с блокированным Y_Z.

Такая корреляция между увеличением скорости электронного транспорта по альтернативному пути и уменьшением амплитуды А_Т-полосы при увеличении концентрации ДФК указывает на участие His-190 в альтернативном переносе электрона.

Полученные результаты в целом свидетельствуют в пользу участия His-190 в альтернативном переносе электрона от экзогенных доноров к Р680.

Литература:

1. Култышева М.Ю., Ловягина Е.Р., Кузнецов А.М., Солнцев М.К., Семин Б.К., Иванов И.И. (2001) Сравнительное исследование влияния экзогенных доноров электронов фотосистемы II на А_Т-полосу термолюминесценции. Биохимия, 66, 884-890.

2. Ono T., Inoue Y. (1991) Biochemical evidence for histidine oxidation in photosystem II depleted of the Mn-cluster for O₂-evolution. FEBS Lett., 278, 183-186.

3. Semin B. K., Ivanov I. I., Rubin A. B., Parak F. (1995). High-specific binding of Fe (II) at the Mn-binding site in Mn-depleted PSII membranes from spinach. FEBS Lett., 375, 223-226.

4. Semin B. K., Ghirardi M. L., Seibert M. (2002). Blocking of electron donation by Mn (II) to Y (Z*) following incubation of Mn-depleted photosystem II membranes with Fe (II) in the light. Biochemistry, 41 (18), 5854-5864.

5. Semin B. K., Lovyagina E. R., Timofeev K. N., Ivanov I. I., Rubin A.B., Seibert M. (2005). Iron-Blocking the High-Affinity Mn-Binding Site in Photosystem II Facilitates Identification of the Type of Hydrogen Bond Participation in Photon-Coupled Electron Transport via Y_Z⁺. Biochemistry, 44 (28), 9746-9757.

6. Tommos C., Babcock G. T. (2000). Proton and hydrogen currents in fotosynthetic water oxidation. Biochim. Biophys. Acta, 1458, 199-219.

7. Vass I., Govindjee (1996). Thermoluminescence from photosynthetic apparatus. Photosynthesis Res. 48, 117-126.