Биологические науки/9. Биохимия и биофизика

Локтюшкин А.В., Чуркина Л.А., к.б.н. Гуськова Р.А., к.б.н. Федоров Г.Е.,
д.б.н. Иванов И.И.

Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия

Влияние AgNO₃ на скорость диссоциации
оксигемоглобина

Тяжелые металлы обладают выраженным токсическим действием на все формы жизни. Патологическое действие соединений тяжелых металлов основано, в первую очередь, на их взаимодействии с клеточными белками. В большинстве случаев, связывание ионов тяжелых металлов с белками вызывает существенное изменение их функциональной активности (Passow et al., 1961).

Наиболее полно изучены эффекты связывания с гемоглобином (Hb) соединений ртути (II). Джибсон и Роутон методом остановленной струи показали, что ртуть-органическое соединение п-хлоромеркуриобензоат (пХМБ) существенно увеличивает константу скорости диссоциации четвертой молекулы кислорода от полностью насыщенного гемоглобина (Gibson, Roughton, 1955). Риггс исследовал влияние различных соединений ртути на кривые кислородной диссоциации гемоглобина. Все исследованные соединения ртути (мерсалил, хлорид ртути, пХМБ и гидроксид метилртути) снижали коэффициент кооперативности связывания кислорода гемоглобином (коэффициент Хилла)
(Riggs, Wolbach, 1956). Кроме того, было показано, что в присутствии пХМБ изменяется форма кинетической кривой диссоциации оксигемоглобина
(Taylor et al., 1966).

В определенных условиях в присутствии соединений Hg²⁺ изменяется не только функциональная активность гемоглобина, но и четвертичная структура молекулы: облегчается диссоциациация тетрамера (α₂β₂) на димеры (αβ), а при большом избытке Hg²⁺ – и на мономеры (α и β) (Rosemeyer, Huehns, 1967).

Влияние соединений других тяжелых металлов (в особенности Ag⁺) на структуру и функциональную активность гемоглобина исследовано значительно хуже (Myshkin, Khromova, 2003).

В данной работе проведено исследование влияния нитрата серебра (AgNO₃) на кинетику реакции диссоциации оксигемоглобина человека. Раствор оксигемоглобина готовили из эритроцитарной массы без лейкоцитарного слоя в гемоконсерванте CFDA, полученной на Московской Городской Станции Переливания Крови от здоровых доноров. Эритроцитарную массу разводили четырьмя объемами гипотонического буфера, содержащего 10 мМ HEPES/NaOH, pH 7,2. Лизированные клетки центрифугировали при 10000 · g в течение
10 мин, чтобы удалить мембраны. Раствор гемоглобина хранили при температуре 4^oС. Концентрацию гемоглобина определяли спектрофотометрически по величине оптической плотности раствора при 542 нм (ε₅₄₂ = 14000 М^-1 · см^-1) на двухлучевом спектрофотометре Shimadzu.

Для получения кинетических кривых реакции диссоциации оксигемоглобина использовали метод остановленной струи с фотометрической регистрацией. Измерения проводили на двухволновом спектрофотометре Aminco DW-2, оснащенном струевой приставкой Aminco-Morrow («мертвое» время – 6 мс). Раствор гемоглобина (10 мкМ) быстро смешивали с раствором, содержащим сильный восстановитель дитионит натрия (52 мМ Na₂S₂O₄,
10 мМ HEPES/NaOH, pH 7,2) в соотношении 1 : 1. Переход HbO₂ → Hb регистрировали в области полосы Сорэ гема при длине волны 430 нм. Сигнал с выхода фотоумножителя подавали на аналогово-цифровой преобразователь компьютера и с помощью временной развертки получали кинетическую кривую изменения оптической плотности в результате протекания реакции. Результаты анализировали с помощью программы Origin 7.0.

Так как при избытке Na₂S₂O₄ весь кислород, имеющийся в растворе, быстро восстанавливается, обратной реакцией взаимодействия гемоглобина с кислородом при расчетах пренебрегали. Реакцию диссоциации оксигемоглобина рассматривали как мономолекулярную с эффективной константой k. Диссоциация оксигемоглобина в этом случае описывается уравнением:

[HbO₂] = [HbO₂]₀ · e^-kt,

где [HbO₂] и [HbO₂]₀ – текущая и начальная концентрации оксигемоглобина,
а t – время. Для определения k начальный участок экспериментальных кинетических кривых аппроксимировали экспоненциальной функцией
(y = A₀ + A₁ · e^-x/τ) и по величине характерного времени экспоненты τ рассчитывали k (k = 1/ τ).

Раствор гемоглобина инкубировали с AgNO₃ при комнатной температуре в течение 10 мин.

На рис. 1 приведены кинетические кривые диссоциации оксигемоглобина для контрольного образца белка и белка, проинкубированного с AgNO₃. Инкубация раствора оксигемоглобина с AgNO₃ приводит к снижению константы скорости диссоциации. Величина константы скорости уменьшается по мере увеличения концентрации AgNO₃. При максимальной концентрации AgNO₃ (200 мкМ) константа скорости снижается в 1,7 раза по сравнению с контролем (рис. 2).

Хорошо известно, что ионы тяжелых металлов эффективно взаимодействуют с SH-группами цистеиновых остатков белков, что в ряде случаев приводит к нарушению функциональной активности. Наибольшим сродством к сульфгидрильным группам обладает Hg²⁺, Ag⁺ по величине сродства лишь незначительно уступает Hg²⁺ (Passow et al., 1961).

В молекуле гемоглобина человека имеется 6 остатков цистеина. С Hg²⁺ взаимодействуют лишь два реакционноспособных остатка, локализованных на β-субъединицах белка в положении 93. Четыре других цистеиновых остатка связывают Hg²⁺ лишь после денатурации гемоглобина
(Rosemeyer, Huehns, 1967).

Мышкин исследовал процесс агрегации оксигемоглобина в присутствии Ag⁺. При низкой концентрации белка начальная скорость агрегации практически не зависела от концентрации ионов Ag⁺ при молярном соотношении Ag⁺/HbO₂ > 2. Основываясь на этих результатах, автор сделал вывод, что связывания Ag⁺ именно β93 цистеиновыми остатками вызывает агрегацию оксигемоглобина (Myshkin, Khromova, 2003). В наших экспериментах концентрация AgNO₃, при которой наблюдалось максимальное снижение константы скорости диссоциации, была равна 200 мкМ, т. е. при соотношении Ag⁺/HbO₂ = 20, что на порядок выше соотношения, полученного Мышкиным. Исходя из этого, можно предположить, что полученное нами значительное снижение константы скорости диссоциации оксигемоглобина в присутствии AgNO₃ вызвано связыванием иона Ag⁺ другими группами белка, не только реакционноспособными SH-группами. Возможно, что этими группами являются имидазольные группы гистидиновых остатков (Myrbäck, 1957).

Литература:

1. H. Passow, A. Rothstein, T. W. Clarkson, The general pharmacology of the heavy metals, Pharmacol. Rev. 13 (1961) 185-224.

2. Q. H. Gibson, F. J. W. Roughton, The kinetics of dissociation of the first oxygen molecule from fully saturated oxyhaemoglobin in sheep blood solutions, Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 143 (1955) 310-334.

3. F. Riggs, R. A. Wolbach, Sulfhydryl groups and the structure of hemoglobin, J. Gen. Physiol. 39 (1956) 585-604.

4. J. F. Taylor, E. Antonini, M. Brunori, J. Wyman, Studies on human hemoglobin treated with various sulfhydryl reagents, J. Biol. Chem. 241 (1966) 241-248.

5. M. A. Rosemeyer, E. R. Huehns, On the mechanism of the dissociation of haemoglobin, J. Mol. Biol. 25 (1967) 253-273.

6. A. E. Myshkin, V. S. Khromova, Peculiar features of aggregation effect of silver (I) ion on hemoglobin, Biochim. Biophys. Acta 1651 (2003) 124-129.

7. K. Myrbäck, Inhibition of yeast invertase (saccharase) by metal ions. V. Inhibition by mercury compounds, Ark. Kemi 11 (1957) 471-479.